荔枝基因槍轉化及其GUS瞬時表達研究

桑慶亮等

摘 要 以幼胚來源的荔枝EC作為受體材料，采用基因槍轟擊的方法將外源gus基因轉入荔枝，并對不同條件下的GUS瞬時表達進行了詳細研究。結果表明：在其它參數不變的條件下，轟擊距離、真空度、可裂膜片壓力、金粉用量、質粒DNA用量等理化參數顯著影響GUS瞬時表達；滲透處理可顯著促進GUS瞬時表達。因此，荔枝EC基因槍轉化的適宜條件為在轟擊距離6 cm、真空度84.66 kPa、可裂膜片壓力7 584.23 kPa、轟擊1次的情況下，每次轟擊用1 μg質粒DNA包裹600 μg金粉對事先用0.25 mol/L前處理4 h的荔枝EC轟擊，并在轟擊后滲透處理20 h。另外，經50 mg/L潮霉素篩選得到荔枝抗性愈傷組織，并通過體胚發(fā)生途徑獲再生植株，且GUS染色顯示獲得了穩(wěn)定表達GUS蛋白的細胞系和植株。

關鍵詞 荔枝；胚性愈傷組織；基因槍；遺傳轉化；瞬時表達

中圖分類號 S667.1 文獻標識碼 A

Abstract In the paper， plasmid pCAMBIA1301 DNA harboring the gus gene encoding β-glucuronidase， coated on gold particles， was delivered into cultured EC via particle bombardment and transformation was monitored by analyzing GUS transient expression in Litchi chinensis Sonn. The results showed that GUS transient expression level was significantly influenced by physical and chemical factors， such as distance to targets， vocuum pressure， helium pressure， gold particle dosage， plasmid DNA dosage， and vitality of litchi EC cells， which affected by growth stages and osmatic treatment. A suitable particle bombardment procedure was proposed. Litchi EC which was pre-cultured on MS medium with 0.25 mol/L mannitol for 4 hours and post-cultured for 20 hours after bombardment was bombarded once using 600 μg gold particles coated with 1 μg plasmid DNA with a vacuum degree of 84.66 kPa， a bombarded distance of 6 cm， and a rupture disk value of 7 584.23 kPa. Hygromycin-resistant embryonic calli（HREC）and plantlets regenerated from HREC were also obtained and GUS stable expression in HREC and leaves were also examined to confirm transformation.

Key words Litchi chinensis Sonn.； Embryonic calli； Particle bombardment； Genetic transformation； Transient expression

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.11.021

荔枝（Litchi chinensis Sonn.）是重要的熱帶亞熱帶木本果樹，主要分布于中國福建、廣東、廣西、云南、四川等省以及世界上許多熱帶亞熱帶地區(qū)，經濟價值較高。由于荔枝是多年生的木本植物，遺傳背景復雜，傳統遺傳育種進展緩慢?，F代植物組織培養(yǎng)技術和轉基因技術的興起與發(fā)展為加速荔枝品種改良提供了強有利的手段。

荔枝組織培養(yǎng)技術的研究始于20世紀80年代。1983年，傅蓮芳和唐道一[1]首先從荔枝花粉培養(yǎng)獲得再生植株。此后，呂柳新等[2]、周麗儂等[3]均通過荔枝幼胚培養(yǎng)獲得再生植株。1997年，俞長河[4]進行了荔枝原生質體分離與培養(yǎng)的工作，并通過體胚發(fā)生途徑獲得再生植株。2000年，Lai等[5-6]對龍眼、荔枝組織培養(yǎng)和體胚發(fā)生進行了總結，至此，荔枝再生體系基本確立。歐陽曙等[7]曾用注射器將根癌農桿菌荔枝初生苗與結果樹枝條上，經培養(yǎng)獲得了愈傷組織，初步證明了T-DNA可用作荔枝基因工程的載體。此后，曾黎輝等[8]均通過農桿菌感染的方式獲得了GUS瞬時表達的結果；Puchooa[9]將GFP基因通過農桿菌感染的方法轉入荔枝愈傷組織和葉片，但未獲得再生植株，Das等[10]通過農桿菌感染的方式將水稻幾丁質酶基因轉入荔枝EC獲得高表達的轉基因植株。這些采用農桿菌對荔枝進行遺傳轉化的研究均出現效率低，轉化體系不完善。基因槍法技術具有2大優(yōu)點[11]：無宿主限制、靶受體類型廣泛，為建立高效荔枝遺傳轉化提供有效途徑。為此，在對荔枝EC進行基因槍轟擊后，獲得了GUS瞬時表達的結果[12]。

本研究在初步基因槍轟擊試驗的基礎上，進一步對影響荔枝胚性愈傷組織（Embryonic calli， EC）轉化的因素進行了試驗，以優(yōu)化轟擊條件，并篩選得到抗性EC，建立起比較穩(wěn)定的荔枝轉化體系，為荔枝遺傳改良奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

供試受體材料為由荔枝晚熟優(yōu)良品種“下番枝”的幼胚誘導并長期繼代的松散型EC。供試質粒為帶有潮霉素抗性基因（hpt）和β-葡萄糖醛酸酶基因（gus）的載體pCAMBIA1301（由福建省農科院農業(yè)遺傳工程重點實驗室王鋒博士提供）。

1.2 方法

1.2.1 質粒DNA提取與純化 質粒DNA提取參照Green等[13]的方法，純化后的質粒DNA在-20 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 受體材料的預處理 轟擊試驗前5～10 d，將旺盛生長的荔枝EC接種到附加1 mg/L 2，4-D的MS培養(yǎng)基上于（25±2）℃、光照條件下預培養(yǎng)。轟擊前4～8 h將荔枝EC轉移到含有甘露醇的滲透培養(yǎng)基上進行滲透處理。

1.2.3 轟擊程序 操作采用BioRad PDS-1000/He型基因槍完成。試驗CaCl2濃度（2.5 mol/L）、亞精胺濃度（0.1 mol/L）、金粉直徑（1 μl）等參數均固定，按儀器使用說明準備金粉和制備微彈?；巨Z擊參數如下，即真空度84.66 kPa、轟擊距離6 cm、可裂膜片壓力7 584.23 kPa、每次轟擊金粉用量600 μg、每次轟擊質粒DNA用量1 μg，0.5 mol/L的甘露醇前處理4 h，后處理16 h，轟擊1次。

1.2.4 單因素試驗設計 在其他參數固定的情況下，以單因素試驗分析了理化因素如轟擊次數（1、2、3次）、真空度（50.80、67.73、84.66、91.43 kPa）、轟擊距離（3、6、9 cm）、可裂膜片壓力（6 205.28、7 584.23、8 963.18 kPa）、每次轟擊金粉用量（60、150、300、600、1 200 μg）每次轟擊質粒DNA用量（0.1、0.2、0.5、1.0、1.5 μg）和與荔枝EC生理活性有關的因素如恢復培養(yǎng)時間（1 h、2 h、1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d、7 d、14 d和21 d）、滲透處理所用甘露醇濃度（0.000、0.125、0.250、0.500、0.750 mol/L）、滲透前處理時間（0、2、4、6、8 h）以及滲透后處理時間（0、16、20、24 h）對GUS瞬時表達的影響。每次轟擊均設不含質粒DNA對照。

1.2.5 GUS瞬時表達檢測 參照Jefferson等[14]的方法并稍作改動。待染色荔枝材料（EC、葉片等）轉入適量X-Gluc染色液（1 mg/mL X-Gluc，5 mmol/L的鐵氰化鉀和5 mmol/L亞鐵氰化鉀，0.1% Triton X-100，用100 mmol/L磷酸鹽緩沖液定容）中，置于37 ℃黑暗條件下保溫12 h，于解剖鏡下觀察記錄藍斑數。以一次轟擊所有的愈傷組織作為一個GUS瞬時表達單位（Transient Expression Unit，TEU），則GUS瞬時表達水平（Transient Expression Level，TEL）表示為藍斑數/TEU。

1.2.6 抗性愈傷組織篩選與再生植株 荔枝抗性EC的篩選采用在含50 mg/L潮霉素的MS培養(yǎng)基中暗培養(yǎng)的方式；再生植株經由體胚發(fā)生途徑，采用在含有5 mg/L玉米素和5%蔗糖的MS培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)的方式；體胚在無激素含5%蔗糖的MS培養(yǎng)基中暗培養(yǎng)以獲得成熟體胚；成熟體胚轉至含2%蔗糖的MS培養(yǎng)基上光照培養(yǎng)使體胚萌發(fā)成苗。

2 結果與分析

2.1 轟擊物理參數對GUS瞬時表達的影響

2.1.1 轟擊次數 轟擊次數影響受體細胞受損程度，本研究試驗了1、2和3次轟擊后GUS瞬時表達情況（圖1）。結果表明，隨轟擊次數增加，GUS瞬時表達水平上升，但轟擊次數對GUS瞬時表達水平的影響不顯著（ANOVA，p>0.05）。

2.1.2 真空度 GUS瞬時表達水平隨真空度提高而提高（圖2），且差異顯著（ANOVA，p<0.05）。其中，真空度為84.66、91.43 kPa時，GUS瞬時表達水平相差不大[分別為（1 532.00±168.94）個藍斑/TEU和（1 544.33±115.94）個藍斑/TEU]，而50.80 kPa時，GUS瞬時表達水平最低[（5.67±3.06）個藍斑/TEU]。

2.1.3 轟擊距離 轟擊距離對GUS瞬時表達的影響表現為先增大后降低的趨勢（圖3），且差異顯著（ANOVA，p<0.05）。其中，轟擊距離6 cm時，GUS瞬時表達水平最高[（1 150.00±201.10）個藍斑/TEU]，9 cm時GUS瞬時表達水平最低[（93.33±12.74）個藍斑/TEU]。多重比較結果表明，兩兩轟擊距離間差異顯著。

2.1.4 可裂膜片壓力 可裂膜片壓力顯著影響GUS瞬時表達水平（ANOVA，p<0.05），且總體上壓力越大GUS瞬時表達水平越高（圖4）。其中，7 584.23 kPa的壓力下，GUS瞬時表達水平最高[（1 876.33±105.46）個藍斑/TEU]，8 963.18 kPa的壓力下次之[（1 535±71.08）個藍斑/TEU]，6 205.28 kPa壓力時最低[（145.67±13.05）個藍斑/TEU]。多重比較發(fā)現，3種壓力兩兩之間GUS瞬時表達的差異均顯著。

2.1.5 每次轟擊金粉用量 金粉用量對GUS瞬時表達的影響也表現為先增高后下降的趨勢（圖5），且差異顯著（ANOVA，p<0.05）。其中，金粉用量600 μg時GUS瞬時表達最強[（2 426.00±553.26）個藍斑/TEU]，而每次轟擊60 μg金粉時GUS瞬時表達最差[（340.00±80.62）個藍斑/TEU]。但多重比較結果表明，金粉用量300～1 200 μg之間，GUS瞬時表達兩兩之間并無明顯差異。

2.1.6 每次轟擊質粒DNA用量 質粒DNA用量對GUS瞬時表達的影響表現為先提高后下降的趨勢（圖6），且差異顯著（ANOVA，p<0.05）。其中，質粒用量0.5 μg時，GUS瞬時表達水平最高[（2 159±249.51）個藍斑/TEU]，無質粒DNA時無GUS表達（圖11-A和B）。多重比較發(fā)現，質粒用量0.2～1.5 μg范圍內，GUS瞬時表達的差異不顯著。

2.2 生理因素對GUS瞬時表達的影響

2.2.1 恢復培養(yǎng)時間 GUS瞬時表達水平隨恢復培養(yǎng)延長而逐漸下降（圖7），且差異顯著（ANOVA，p<0.05）。轟擊后1～2 h，GUS無瞬時表達（檢測到0個藍斑/TEU）；1 d左右，GUS瞬時表達水平最高[（1 462±116.38）個藍斑/TEU]，隨后GUS活性逐漸衰退，到7 d時已經很微弱[（96±10.71）個藍斑/TEU]；14、21 d，藍斑數極少[分別為（16.67±2.62）、（6.33±1.70）個藍斑/TEU]。多重比較結果也表明，轟擊后1 d顯著高于2～21 d時。

2.2.2 甘露醇濃度 隨甘露醇濃度增高，GUS瞬時表達水平呈先上升后下降的趨勢（圖8），且差異顯著（ANOVA，p<0.05）。其中，0.25 mol/L的甘露醇，GUS瞬時表達水平最高[（1 576.67±131.79）個藍斑/TEU]，未經甘露醇處理的荔枝EC中GUS瞬時表達水平最低[（31.67±6.11）個藍斑/TEU]，表明甘露醇處理是影響基因槍轟擊后GUS瞬時表達的重要因素。

2.2.3 滲透前處理時間 其它轟擊條件固定，以0.25 mol/L的甘露醇作為滲透劑，隨滲透前處理時間增加，GUS瞬時表達水平呈先增高后下降的趨勢（圖9），但差異不顯著（ANOVA，p>0.05）。其中，4 h前處理，GUS瞬時表達最高[（1 155.33±274.38）個藍斑/TEU]，未進行前處理，則GUS瞬時表達水平最低[（760.00±143.06）個藍斑/TEU]。

2.2.4 滲透后處理時間 固定甘露醇濃度為0.25 mol/L，滲透后處理可明顯促進GUS瞬時表達（圖10），且差異顯著（ANOVA，p<0.05）。多重比較結果顯示，無滲透后處理，則GUS瞬時表達水平[（430.33±74.85）個藍斑/TEU]顯著低于有滲透后處理的GUS瞬時表達水平，而后處理16、20、24 h的荔枝EC中GUS瞬時表達水平無顯著差異。

2.3 抗性EC篩選與再生植株

經50 mg/L潮霉素篩選3個月，得到荔枝抗性愈傷組織（Hygromycin-resistant embryonic calli，HREC），取少量HREC于X-Gluc染色液中浸泡，穩(wěn)定顯藍色（圖11-C）；置于倒置顯微鏡下可觀察，發(fā)現HREC內部被染成藍色的組織（圖11-D），表明荔枝HREC可穩(wěn)定地表達GUS蛋白，即本研究通過基因槍轟擊的方法獲得了穩(wěn)定轉化的細胞系。

在含有5 mg/L玉米素和5%蔗糖的MS培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng)約1個月即可得到大量白色體胚。將白色體胚在含10%椰子汁和5%蔗糖的MS培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)，經2～3個月暗培養(yǎng)，得到了直徑0.5～1.0 cm的成熟體胚。轉入無激素MS培養(yǎng)基上，光照培養(yǎng)1～2個月得到了荔枝抗性EC的再生植株（圖11-E）。將再生植株的葉片切成細小條狀進行GUS活性檢測，切口明顯染成藍色，可以初步確定為轉基因植株（圖11-F）。

3 討論與結論

3.1 優(yōu)化理化因素可以明顯提高轉化效率

各理化因素影響轉化效率的機制是對轟擊強度與細胞損傷程度這對矛盾的權衡中實現的。一方面，提高真空度、縮短轟擊距離、提高可裂膜片壓力會提高微彈的速度，能有效地將外源DNA送達準確的位置；另一方面，轟擊強度增加必然帶來生物材料受損程度提高，隨轟擊后時間的延長，大量細胞死亡，造成GUS瞬時表達水平下降。反之，如果真空度下降、可裂膜片壓力下降，GUS瞬時表達水平下降，可能的原因是只有少量外源DNA能夠到達準確位置。

本研究發(fā)現轟擊距離、可裂膜片類型、DNA用量、金粉用量、真空度等理化因素均顯著影響GUS瞬時表達水平，而轟擊次數、對GUS瞬時表達影響不大。這些理化因素的水平通過影響受體材料的生理狀態(tài)來影響GUS瞬時表達水平。Rasco-Gaunt等[15]認為較低壓力下，金粉分散面積大且均勻，對細胞傷害小，而高壓力下金粉分散面積小且對細胞傷害大，造成GUS瞬時表達水平下降且不均一。

本研究中還發(fā)現，相對較強的轟擊條件（比如更高的真空度）對GUS瞬時表達有利，這一結論與Folling等[16]的看法相似。

3.2 改善受體材料的生理活性有助于提高轉化效率

一般認為生理活性高的組織或細胞，其DNA活躍，有利于外源DNA的攝入與融合，且受體細胞DNA的活躍程度與滲透壓有關。已有研究證實，滲透處理可增強瞬時和穩(wěn)定表達水平[17-19]。本研究發(fā)現，甘露醇滲透處理使荔枝EC轟擊后GUS瞬時表達水平顯著提高，證實了上述說法。

滲透處理提高轉化效率的可能原因：前處理可能使細胞發(fā)生質壁分離，轟擊時原生質體免受損傷[17]；后處理則為受損細胞提供有利的膜修復環(huán)境，促進受損細胞恢復。但是，本研究中高濃度甘露醇（0.5 mol/L和0.75 mol/L）處理的效果均較較低濃度甘露醇（0.25 mol/L）處理的效果差，且滲透處理時間過長GUS瞬時表達水平也會下降，表明滲透處理時間以及滲透劑濃度是非常重要的，如果時間過長或濃度過高，同樣會對受體細胞產生較大的影響，從而影響其活力，進而影響其遺傳轉化。

3.3 荔枝EC基因槍轉化的意義

3.3.1 荔枝HREC是很好的細胞學研究材料 細胞生物學與細胞遺傳學研究中，細胞融合是非常有用的技術手段，但近緣物種之間由于基因組存在很大的相似性，以自身基因或DNA序列作為鑒定標記難以區(qū)分，利用報告基因進行鑒定是可行的。如黃枝英等[20]利用本研究得到的HREC分離原生質體并高頻獲得再生植株，黃淺[21]用上述原生質體細胞系與龍眼進行細胞融合試驗。

3.3.2 穩(wěn)定的瞬時表達體系為基因功能研究提供重要手段 瞬時表達分析是對基因產物的功能進行分析時不可或缺的重要手段。雖然在植物中，農桿菌可以用于許多物種的瞬時表達分析，但是對于荔枝來說，仍然不適用。基因槍技術可以穩(wěn)定地將外源基因導入植物組織，并借此研究基因產物的生物學功能和亞細胞定位。這一過程一般在1周內完成[22]，因而本研究建立的高效基因槍轉化體系在荔枝及近緣種基因功能研究中具重要意義。

3.3.3 拓寬荔枝轉基因受體材料的范圍，促進荔枝遺傳改良 由于荔枝是多年生木本植物，遺傳背景復雜，成體的優(yōu)良性狀很難在下一代植株中保持，使用葉、莖尖、側芽等成體材料意義重大，因此，改進組織培養(yǎng)技術拓寬荔枝轉基因受體材料的范圍是促進荔枝遺傳改良的基礎，近年這方面的研究取得了一定的成果[23-26]，但大規(guī)模再生植株仍存在較大困難。一旦再生體系得以建立，利用基因槍法轉化荔枝EC的優(yōu)化程序，就有可能在短時間內通過轉基因方式對荔枝品種進行遺傳改良。

致 謝 本研究的部分內容在福建省農科院遺傳改良重點實驗室完成，并得到王鋒博士的大力支持與幫助，謹致謝忱！

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