一株A型副雞嗜血桿菌的分離鑒定

李峰　苗立中　沈志強(qiáng)

摘 要：從山東省某蛋雞場(chǎng)發(fā)病雞群中分離到一株細(xì)菌，經(jīng)培養(yǎng)特性觀察、生化試驗(yàn)、V因子生長試驗(yàn)、致病性試驗(yàn)和PCR試驗(yàn)，證實(shí)分離菌為一株致病性副雞嗜血桿菌，血清型鑒定該菌為A型。藥物敏感性試驗(yàn)表明分離菌對(duì)頭孢噻肟、頭孢曲松、丁胺卡那霉素高度敏感，對(duì)硫酸新霉素、強(qiáng)力霉素中度敏感，對(duì)磺胺間甲氧嘧啶鈉、環(huán)丙沙星、慶大霉素耐藥。

關(guān)鍵詞：A型；副雞嗜血桿菌；傳染性鼻炎；分離鑒定近日，山東某養(yǎng)殖場(chǎng)一批140日齡左右的雞群出現(xiàn)面部單側(cè)或雙側(cè)腫脹，流鼻涕、打噴嚏癥狀，并且2d內(nèi)產(chǎn)蛋率下降約10個(gè)百分點(diǎn)，場(chǎng)主即攜帶發(fā)病雞到我院獸醫(yī)診斷中心就診。經(jīng)病原分離、生化試驗(yàn)、V因子生長試驗(yàn)、致病性試驗(yàn)和PCR鑒定，確診為A型副雞嗜血桿菌感染，經(jīng)藥敏試驗(yàn)，選擇敏感藥物治療，較快控制了疫情。現(xiàn)將試驗(yàn)情況報(bào)告如下。

1 材料

1.1 病料 3只發(fā)病雞，山東某養(yǎng)殖場(chǎng)提供。

1.2 試驗(yàn)雞 10只30日齡非免疫健康雞，由山東綠都生物科技有限公司實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.3 培養(yǎng)基 雞鮮血瓊脂、雞血清肉湯瓊脂、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基，按文獻(xiàn)方法[1]自制。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)副雞嗜血桿菌陽性血清 山東省濱州獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.5 細(xì)菌微量生化反應(yīng)管 購于杭州天和微生物試劑有限公司。

1.6 藥敏試驗(yàn)紙片 購自北京天壇藥物技術(shù)開發(fā)公司。

1.7 PCR擴(kuò)增引物 參照GenBank中副雞嗜血桿菌的基因序列，借助Primer5.0引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)1對(duì)引物。

A上游5-GCGGGACACGATGTGGCTAT-3，B下游5-TGGCGATGACGTTCCTCAAT-3，由上海生工合成。

2 方法

2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng) 將病雞處死，用棉拭子沾取眶下竇內(nèi)容物，分別劃線接種于雞鮮血瓊脂、雞血清肉湯瓊脂、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上，置5%的CO2培養(yǎng)箱，37℃培養(yǎng)16～24h后觀察，挑取單個(gè)可疑菌落接種到含血清的雞肉湯培養(yǎng)基中進(jìn)行純培養(yǎng)，同時(shí)涂片，革蘭氏染色、鏡檢。

2.2 生化鑒定 將純化好的細(xì)菌劃線培養(yǎng)后，取單個(gè)菌落接種于生化反應(yīng)管內(nèi)，并在微量發(fā)酵管中分別加入0.2ml的雞血清和濃度為1%的輔酶I 0.2ml，用蠟封口，倒置于放有脫脂棉的平皿內(nèi)，37℃厭氧罐中培養(yǎng)24～48h，觀察結(jié)果。

2.3 V因子生長試驗(yàn) 用接種環(huán)蘸取新鮮的肉湯培養(yǎng)物，在無NAD的雞血清肉湯瓊脂上劃8～10條橫線，再用金黃色葡萄球菌劃一豎線，翻轉(zhuǎn)平板置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)18～20h，觀察分離物是否出現(xiàn)衛(wèi)星現(xiàn)象。

2.4 致病性試驗(yàn) 將純培養(yǎng)的菌落接種于雞血清肉湯中培養(yǎng)24h，接種30日齡齡非免疫健康小公雞6只，每只雞各取0.2ml培養(yǎng)物進(jìn)行眶下竇接種，同時(shí)滴鼻（1×108CFU/ml）；同時(shí)用生理鹽水接種4只試驗(yàn)雞，0.2ml/只，作為對(duì)照組。分別隔離飼養(yǎng)觀察。對(duì)出現(xiàn)典型癥狀的雞，無菌采取眶下竇分泌物，進(jìn)行本菌的回收培養(yǎng)。

2.5 PCR鑒定 以分離菌雞血清雞肉湯純培養(yǎng)物2m作為模板進(jìn)行PCR鑒定。采用25反應(yīng)體系（超純水17μl、10×PCR buffer 2.5μl、dNTP 2.0μl、A和B各1μl、模板1μl、rTap酶0.5μl）于95℃變性5min，25個(gè)循環(huán)（94℃1min，53.9℃1min，72℃2min）最后72℃延伸10min。1%的瓊脂糖凝膠電泳，觀察結(jié)果。

2.6 血清型鑒定 用常規(guī)凝集試驗(yàn)方法，取純化菌株與A、B、C型副雞嗜血桿菌的標(biāo)準(zhǔn)陽性血清進(jìn)行凝集試驗(yàn)。

2.7 藥敏試驗(yàn) 用紙片法進(jìn)行，對(duì)分離菌用頭孢噻肟、頭孢曲松、丁胺卡那霉素、硫酸新霉素、強(qiáng)力霉素、磺胺間甲氧嘧啶鈉、環(huán)丙沙星、慶大霉素共八種藥物在雞肉湯瓊脂平板上，按常規(guī)紙片法進(jìn)行了藥敏試驗(yàn)。

3 結(jié)果

3.1 細(xì)菌分離鑒定結(jié)果 無菌接種培養(yǎng)基24h后，在麥康凱瓊脂、鮮血瓊脂平板上，均無菌生長。在雞血清肉湯瓊脂上長出灰白色露滴狀、邊緣整齊、表面光滑、有輕度隆起、粘液狀、濕潤、有光澤、不透明、邊緣有虹彩的菌落。挑取菌落涂片，染色、鏡檢，為革蘭氏陰性球桿菌，單個(gè)、成對(duì)或多個(gè)堆積在一塊。

3.2 生化試驗(yàn)結(jié)果 分離菌能夠發(fā)酵葡萄糖、木糖、麥芽糖、蔗糖、甘露糖，不發(fā)酵乳糖、菊糖、鼠李糖、山梨醇、和肌醇，過氧化氫酶反應(yīng)陰性，硫化氫試驗(yàn)陰性，吲哚試驗(yàn)陰性，硝酸鹽還原試驗(yàn)陽性。

3.3 V-因子需求試驗(yàn)結(jié)果 培養(yǎng)24h后觀察，在靠近金黃色葡萄球菌劃線處，該菌菌落生長密集，比較大，成半透明狀，遠(yuǎn)離金黃色葡萄球菌處的菌落則生長稀少，也比較小，呈較典型的“衛(wèi)星現(xiàn)象”。

3.4 致病性試驗(yàn)結(jié)果 試驗(yàn)雞接種后5d開始出現(xiàn)發(fā)病癥狀，到第7天流鼻液，不同程度的單側(cè)臉部和眼瞼腫脹，個(gè)別雞有呼吸困難。對(duì)照組雞正常。從人工感染發(fā)病雞的眶下竇的分泌物中均能分離到本菌。

3.5 PCR鑒定 分離菌DNA的提取由BioTeke基因組DNA提取試劑盒提?。ò凑赵噭┖姓f明書提?。訢NA基因組為模板PCR擴(kuò)增，獲得了939bp的目的陽性條帶（如圖1）。

3.6 血清型鑒定結(jié)果 分離菌能夠與A型雞副嗜血桿菌的標(biāo)準(zhǔn)陽性血清在3～5min內(nèi)出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，且與B、C型雞副嗜血桿菌的標(biāo)準(zhǔn)陽性血清無凝集發(fā)生。同時(shí)陽性對(duì)照和陰性對(duì)照均成立。

3.7 藥敏試驗(yàn)結(jié)果 分離菌對(duì)頭孢噻肟、頭孢曲松、丁胺卡那霉素高度敏感，對(duì)硫酸新霉素、強(qiáng)力霉素中度敏感，對(duì)磺胺間甲氧嘧啶鈉、環(huán)丙沙星、慶大霉素耐藥。

4 小結(jié)與討論

4.1 根據(jù)臨床癥狀、細(xì)菌分離培養(yǎng)、生化試驗(yàn)、V因子生長試驗(yàn)、致病性試驗(yàn)和PCR試驗(yàn)及血清型鑒定，證明病原為A型副雞嗜血桿菌。通過藥敏試驗(yàn)，選擇丁胺卡那霉素用于該場(chǎng)治療，在短時(shí)間內(nèi)有效控制了疫情。

4.2 副雞嗜血桿菌主要導(dǎo)致傳染性鼻炎臨床癥狀主要特征為流鼻涕、打噴嚏、單側(cè)或雙側(cè)眼瞼水腫，并能導(dǎo)致產(chǎn)蛋雞產(chǎn)蛋量下降10%～40%不等，若與其他病毒性疾病并發(fā)，死亡率具增高趨勢(shì)[2]。

4.3 副雞嗜血桿菌的培養(yǎng)需要V因子，由于葡萄球菌具有產(chǎn)生V因子的特性。所以常利用與葡萄球菌同培養(yǎng)的方式，以是否產(chǎn)生“衛(wèi)星現(xiàn)象”作為該菌鑒定的重要依據(jù)[3]。本試驗(yàn)符合這一特性。

4.4 按Page的分型方法，副雞嗜血桿菌可分為A、B和C三個(gè)血清型，我國于1987年首次在北京分離到副雞嗜血桿菌[4]，目前A、B和C三個(gè)血清型已均有報(bào)道[5-7]。而目前我國批準(zhǔn)使用疫苗多為A、C型二價(jià)疫苗，所以常見病例多是由于未正常免疫或者是由于新的血清型的出現(xiàn)導(dǎo)致免疫失敗引起的。因此，研制開發(fā)新的含三種血清型的疫苗是提高防控本病的有效手段。

參考文獻(xiàn)：

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