DNA條形碼技術(shù)及其在畜牧產(chǎn)品中的應(yīng)用前景

廖俊 應(yīng)孟周 張曉芹 顧選2

[摘 要] 近年來，隨著國際上DNA條形碼技術(shù)的發(fā)展，中國也越來越多的將DNA條形碼技術(shù)應(yīng)用到植物及中藥材的鑒定及相關(guān)研究中，然而此技術(shù)在畜牧產(chǎn)品中的應(yīng)用卻還少見報(bào)道。本文綜述了DNA條形碼技術(shù)的原理、方法流程及其在動(dòng)物研究中的應(yīng)用，并對(duì)DNA條形碼在畜牧產(chǎn)品中的應(yīng)用前景進(jìn)行展望。

[關(guān)鍵詞] DNA條形碼 COI 畜牧產(chǎn)品 前景

[中圖分類號(hào)] Q819 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1003-1650 （2014）01-0252-02

近年來，DNA條形碼技術(shù)受到了國際和國內(nèi)的高度關(guān)注，并在動(dòng)植物的鑒定領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。DNA條形碼技術(shù)首先是由Tautz[1]等在2002年提出，并將其應(yīng)用于生物分類系統(tǒng)，Hebert等[2，3]在2003年首次提出DNA條形碼（DNA Barcoding）概念，并將其用于快速鑒定物種的標(biāo)記物。到目前為止，國際上已經(jīng)建立了包括生命條碼聯(lián)合會(huì)（Consortium forthe Barcode of Life， CBOL，http：// w ww.barcodeoflife.org），生命條碼數(shù)據(jù)庫（Barcode of Life Datasystems， BOLD，http：//www.boldsystems.org），以及國際生命條碼計(jì)劃（International Barcode of Life， iBOL，http：//www.ibol.org）在內(nèi)的3個(gè)大型資源網(wǎng)站，吸引了50多個(gè)國家的投資者及合作組織。這些生命條碼組織的成立，進(jìn)一步推動(dòng)了DNA條形碼技術(shù)的發(fā)展。近年來，中國本土也形成了很多包括植物、動(dòng)物及中藥材在內(nèi)的生物DNA條形碼數(shù)據(jù)庫，為物種鑒定及生物系統(tǒng)發(fā)育研究的發(fā)展提供了有力的基因證據(jù)。

一、DNA條形碼技術(shù)的原理

條形碼技術(shù)是一種通過對(duì)條形碼進(jìn)行電子掃描，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)信息進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的自動(dòng)識(shí)別方法，目前已廣泛應(yīng)用與商品零售業(yè)[4]。DNA條形碼與之類似，即利用基因組中一段公認(rèn)的、相對(duì)較短的DNA序列來進(jìn)行物種鑒定及其相關(guān)研究。DNA序列是由A、T、G、C 4種堿基組成，不同的堿基數(shù)目分別以不同的順序進(jìn)行排列組合就會(huì)有足夠多數(shù)目的基因序列，從而包括所有物種的基因型[5，6]。

二、DNA條形碼操作的方法流程

1.樣品處理及DNA提取 首先對(duì)樣品進(jìn)行液氮冷凍及酒精消毒等處理工作。其次是進(jìn)行DNA提取，DNA提取方法一般包括破碎細(xì)胞壁并釋放DNA，分離DNA，純化DNA，DNA濃縮、沉淀與洗滌等基本步驟[7]。目前常用的DNA提取方法有CTAB[8]法，高鹽低PH[9]法，SDS[10]法以及試劑盒提取法等。對(duì)于植物樣品，一般選擇CTAB法 [11]，對(duì)于動(dòng)物樣品，一般采用SDS（十二烷基硫酸鈉）原理提取DNA [12]。隨著近年來DNA提取試劑盒的問世，試劑盒法已經(jīng)廣泛用于動(dòng)植物DNA的提取。

2.PCR擴(kuò)增

PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）擴(kuò)增就是使提取出的樣品DNA在PCR擴(kuò)增儀內(nèi)進(jìn)行反應(yīng)，以達(dá)到DNA的數(shù)量成指數(shù)增長的效果。對(duì)于植物PCR擴(kuò)增，目前國內(nèi)一般采用葉綠體基因[13，4]和核基因[15]片段為目的基因。對(duì)于動(dòng)物的PCR擴(kuò)增，國內(nèi)應(yīng)用最多的動(dòng)物條形碼是COI基因。另外，線粒體基因以及核基因也越來越多的被用于動(dòng)物研究中。

3.PCR產(chǎn)物檢測及測序

目前，一般采取瓊脂糖凝膠電泳方法檢測 PCR產(chǎn)物，采用Sanger雙向測序的方法。隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，國內(nèi)的測序技術(shù)也在進(jìn)一步提高。

4.獲得DNA條形碼 將測序返回的結(jié)果利用Choromas軟件查看峰圖質(zhì)量，ContingExpress軟件進(jìn)行雙向序列拼接，Bioedit軟件進(jìn)行序列編輯，最終獲得DNA條形碼。

三、DNA條形碼技術(shù)在動(dòng)物研究中的應(yīng)用

1.DNA條形碼在昆蟲中的應(yīng)用

早在21世紀(jì)初，我國學(xué)者就已經(jīng)利用線粒體COI基因?qū)€蟲、蛔蟲、水蚤和吸蟲等線形動(dòng)物進(jìn)行了序列差異研究。之后Hajibabaei M等基于COI基因?qū)[翅目521種昆蟲進(jìn)行了序列分析，發(fā)現(xiàn)對(duì)其物種鑒別效率可以達(dá)到97.9%。潘程瑩等對(duì)7種蝗蟲的線粒體COI基因進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)基于COI基因可以實(shí)現(xiàn)對(duì)蝗蟲的鑒別，并揭示了蝗蟲的系統(tǒng)進(jìn)化歷程。這表明DNA條形碼在昆蟲類的鑒別研究中已經(jīng)相當(dāng)成熟。

2.DNA條形碼在魚類中的應(yīng)用

DNA條形碼在魚類中的開發(fā)和應(yīng)用也較為廣泛。Ward等對(duì)澳大利亞207種海洋魚類進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)所有物種在COI基因上都有一定差異，通過系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的構(gòu)建，發(fā)現(xiàn)COI基因可作為海洋魚類DNA條形碼的標(biāo)準(zhǔn)序列。此外，Zemlak等用COI基因研究印度洋沿岸35種魚的229個(gè)樣本發(fā)現(xiàn)，南非和澳大利亞海域的同種魚類存在很大的差異，指出南非和澳大利亞海域應(yīng)該還有很多隱存種沒有被人發(fā)現(xiàn)。王中鐸等利用COI基因?qū)δ虾Ｓ补囚~類進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，COI基因可用于硬骨魚類的物種鑒別，并可用于低級(jí)分類階元的系統(tǒng)進(jìn)化分析。這些研究表明，COI基因不僅可以用于動(dòng)物物種的鑒定，還可以用于分析物種的系統(tǒng)進(jìn)化歷程，尋找物種基因差異性原因，這對(duì)于動(dòng)物隱存種的發(fā)現(xiàn)及生物多樣性的保護(hù)具有一定的實(shí)際意義。

3.DNA條形碼在軟體動(dòng)物中的應(yīng)用

軟體動(dòng)物種類較多，現(xiàn)存種類大約8萬種，為世界第二大門類，目前海洋生軟體動(dòng)物已有不少報(bào)道。Johnson等對(duì)20個(gè)種類的帽貝（Lepetodrilus limpets）進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，大部分種都可以通過COI基因進(jìn)行區(qū)別開。Mikkelsen等[對(duì)12種雙殼類的COI基因進(jìn)行分析，結(jié)果顯示種內(nèi)差異和種間差異沒有重疊，COI基因還可以作為雙殼類的DNA條形碼。COI基因由于其具有較快的進(jìn)化速率，且PCR擴(kuò)增較容易，已經(jīng)越來越多的被應(yīng)用到軟體動(dòng)物的鑒別研究。

4.DNA條形碼在鳥類中的應(yīng)用

哺乳動(dòng)物是和人類生產(chǎn)活動(dòng)密切相關(guān)的一類動(dòng)物，目前對(duì)于哺乳動(dòng)物DNA條形碼研究還較少，主要研究集中在鳥類動(dòng)物上。Efe等基于包括COI 和Cytb在內(nèi)5種基因片段對(duì)瀕危動(dòng)物白嘴端燕鷗的研究發(fā)現(xiàn)，該物種還存在兩個(gè)隱存種。Fleischer等[利用12SrDNA等6種線粒體基因?qū)?0種瀕危象牙嘴啄木鳥的親緣關(guān)系進(jìn)行研究，結(jié)果表明其中7個(gè)來自北美洲自然博物館，3個(gè)來自古巴野生種。Webb等[還利用COI基因，Cytb基因及12S基因?qū)ψ哪绝B科部分鳥類進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育相關(guān)研究，結(jié)果表明美洲類群的啄木鳥是來自于歐亞類群的入侵種。DNA條形碼在鳥類中的應(yīng)用研究比較廣泛，其在揭示鳥類的進(jìn)化歷史，物種遷徙以及遺傳漂變方面發(fā)揮了重要作用。

四、DNA條形碼在畜牧產(chǎn)品中的應(yīng)用前景

目前，DNA條形碼技術(shù)在常用畜牧產(chǎn)品中的研究還比較少，國內(nèi)僅有幾篇文獻(xiàn)開展了類似研究。李新光等[35]利用COI基因?qū)ν庠谛螒B(tài)一致的冷凍魚、凍魚片及烤魚片中的魚肉成分來源進(jìn)行了鑒別，結(jié)果發(fā)現(xiàn)10 種凍鱈魚片樣品主要以“狹鱈”為主（7/10），存在將“白鱈魚”標(biāo)識(shí)為“銀鱈魚”的現(xiàn)象；烤魚片樣品與其標(biāo)簽上所標(biāo)識(shí)的原料多數(shù)不符，一些烤魚片還發(fā)現(xiàn)有月尾兔頭鲀，說明DNA條形碼技術(shù)可以用于畜牧產(chǎn)品的來源鑒定。徐向明[36]以我國3個(gè)地方品種鴨為研究對(duì)象，通過測定COI基因，發(fā)現(xiàn)3個(gè)地方的品種鴨具有與其他地方相區(qū)別的單倍型，并且也分別具有其各自的特異單倍型，說明利用COI基因可以鑒別不同地方鴨的品種。張蓉等[利用COI基因?qū)κ袌錾系幕谷祝R鹿茸及其混偽品進(jìn)行了準(zhǔn)確的鑒別，進(jìn)一步說明了DNA條形碼在畜牧產(chǎn)品品種鑒別上的可行性。此外，Wang 等[通過測定浦東白豬和沙烏頭豬線粒體控制區(qū)（mtDNA D-loop）序列，并利用太湖流域其他地方豬在GenBank里的序列信息，對(duì)這些地方豬的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系進(jìn)行了分析，結(jié)果表明，太湖流域的這些地方豬種的系統(tǒng)發(fā)育樹分為兩大支，而浦東白豬只分布在其中的一支內(nèi)，估計(jì)大約在0.26～0.75 億年以前，浦東白豬與其他四種豬就已經(jīng)分離開來，也就說浦東白豬是一個(gè)獨(dú)立的地方豬種，與其他地方豬沒有基因交流，應(yīng)該作為一個(gè)單獨(dú)品種進(jìn)行保護(hù)。

畜牧產(chǎn)品在我國市場上占據(jù)相當(dāng)大的比例，隨著養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，畜牧產(chǎn)品在市場上所占據(jù)的比例也會(huì)逐步增加，如何確保畜牧產(chǎn)品的來源準(zhǔn)確，品種精確已經(jīng)成為畜牧業(yè)發(fā)展中所面臨的一個(gè)新問題。DNA條形碼技術(shù)的發(fā)展給畜牧業(yè)帶來了新的啟發(fā)，尤其是對(duì)于外在形態(tài)相似的畜牧產(chǎn)品來說，運(yùn)用DNA條形碼技術(shù)對(duì)其進(jìn)行準(zhǔn)確的來源鑒定將對(duì)控制畜牧產(chǎn)品的品種與質(zhì)量，維護(hù)市場秩序，保證消費(fèi)者及第三方利益具有重要的意義。另外，目前在畜牧業(yè)發(fā)展中保護(hù)稀缺品種也是實(shí)現(xiàn)畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展的一個(gè)重要舉措，基于DNA條形碼技術(shù)可以估計(jì)物種的遺傳多樣性及系統(tǒng)進(jìn)化歷程，推測物種的起源中心，將其應(yīng)用于畜牧業(yè)中瀕危物種的保護(hù)也具有一定的可行性。因此，DNA條形碼技術(shù)在畜牧產(chǎn)品中具有極大的應(yīng)用前景，將其引進(jìn)并合理應(yīng)用對(duì)于畜牧業(yè)發(fā)展具有非常重要的意義。

參考文獻(xiàn)

[1] Tautz D，Arctander P，Minelli A， et a1.DNA points the way ahead in taxonomy.Nature 2002，4l8（6897）：479.

[2] Hebert P，Cywinska A，Ball S L，et a1.Biological identifications through DNA barcodes.Proc R Soc Lond B，2003a，270（1512）：313～ 321.

[3] Hebert P，Ratnasingham S，W aard J D.Barcoding animal life：cytochrome coxidase

subunit 1 divergences among closely related species.Proc R Soc Lond B （Supp1），2003，270：S96～ S99.

[4] 程佳月，王麗華，彭克美，等.國際生命條形碼計(jì)劃——DNA Barcoding[J].中國畜牧獸醫(yī)，2009，36（8）：49～53.

[5] 肖金花，肖暉，黃大衛(wèi).生物分類學(xué)的新動(dòng)向—— DNA條形編碼[J].動(dòng)物學(xué)報(bào)，2004，50（5）：852～855.

[6] Folmer O， Black M， Hoeh W， et al. DNA primers for amplification of mitochondrial cytochromecoxidase subunit I from diversemetazoan invertebrates[J]. Mol Mar Biol Biotechnol， 1994， 3：294-299.

[7] 陳士林，姚輝，韓建萍，等.中藥材DNA條形碼分子鑒定指導(dǎo)原則[J].中國中藥雜志，2013，38（2）：141～147.

[8] 趙志常，陳業(yè)淵，高愛平，等.改良CTAB法提取番石榴總DNA的初步研究[J].北方園藝，2013，9：123～125.

[9] 許理文，王鳳格，趙久然，等.高鹽低PH值法提取玉米基因組DNA的研究 [J].玉米科學(xué)，2009，17（1）：59～61.

[10] 徐廣，郭予元，梁革梅，等.SDS-苯酚法提取高質(zhì)量的棉鈴蟲DNA [J].昆蟲知識(shí)，2000，37（3）：174～178.

[11] 易慶平，羅正榮，張青林.植物總基因組DNA提取純化方法綜述 [J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，35（25）：7789～7791.

[12] 周麗，李飛，魏剛.動(dòng)物DNA提取方法概述[J]. Animal Husbandry & Veterinary

Medicine，2008，40（3）：66～68.

[13] 孫華欽，羅科，鄒文俊，等.穿龍薯蕷、黃山藥和盾葉薯蕷psbA-trnH片段序列分析 [J].應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào)，2006，（6）：792-797.

[14] 劉靜，何濤，淳澤，等.藥用石斛的葉綠體matK基因序列分析及鑒別[J].藥學(xué)學(xué)報(bào)，2009，（9）：1051-1055.

[15] 栗丹，李振堅(jiān)，毛萍，等.基于ITS序列石斛材料的鑒定及系統(tǒng)進(jìn)化分析[J].園藝學(xué)報(bào)，2012，39（8）：1539-1550.

作者簡介：廖俊，（1979-），男，漢族，助理畜牧師，麗水市松陽縣畜牧獸醫(yī)局；

通訊作者：劉春生，男，漢族，北京中醫(yī)藥大學(xué)教授、博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)樗幱弥参锖头肿由帉W(xué)。