不同檢測方法在抗菌肽抑菌效果評價的比較研究

潘曉倩等

摘 要：目的：比較5種抗菌肽活性測定方法。方法：以金黃色葡萄球菌、溶血性葡萄球菌和枯草芽孢桿菌為實(shí)驗(yàn)菌株，研究牛津杯法、打孔法、濾紙片法、酶標(biāo)比濁法和活菌計(jì)數(shù)法對不同質(zhì)量濃度的抗菌肽抑菌活性評價的比較。結(jié)果：3 種瓊脂擴(kuò)散定性抑菌實(shí)驗(yàn)中，打孔法靈敏度高，抑菌圈清晰規(guī)則，效果最好；2 種定量抑菌實(shí)驗(yàn)中，活菌計(jì)數(shù)法結(jié)果判定更直觀，靈敏度高，效果最好。結(jié)論：抗菌肽抑菌活性研究過程中，選用打孔法定性與活菌計(jì)數(shù)法定量相結(jié)合的方法，能夠更全面、準(zhǔn)確地反應(yīng)其抑菌活性。

關(guān)鍵詞：抗菌肽；抑菌活性；測定方法

Abstract： Objective： To comparatively evaluate the performance of several antimicrobial peptide activity assays. Methods： Using Staphylococcus aureus， Staphylococcus haemolyticus and Bacillus subtilis as experimental strains， the antimicrobial activity of the antimicrobial peptide nisin at different concentrations was determined by Oxford cup method， punching method， filter paper method， microtiter plate assay and viable count method， respectively. Results： Among three agar-diffusion methods， punching method was the most sensitive， which provided clear and regular inhibition rings. Our comparison of two quantitative activity assays indicated that viable count method， showing high sensitivity and intuitive results， was better than microtiter plate assay. Conclusion： Combined application of punching method and viable count method allows comprehensive and accurate measurement of antimicrobial peptide activity.

Key words： antimicrobial peptide； antimicrobial activity； assay

中圖分類號：TS251 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1001-8123（2014）12-0017-04

抗菌肽是生物體在抵御病原微生物的防御反應(yīng)過程中產(chǎn)生的一類具有抗菌作用的小分子多肽，其特有的氨基酸組成與結(jié)構(gòu)可以破壞細(xì)菌細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致其死亡[1-2]?？咕牟粌H具廣譜抗菌活性，對多種腫瘤細(xì)胞和癌實(shí)體瘤的生長均有明顯抑殺作用，且安全無毒、具有保健作用，是食品防腐保鮮劑研究開發(fā)的一個新的方向[3-5]。因此，抗菌肽具有十分廣闊的應(yīng)用前景，但沒有統(tǒng)一的活力計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)。測定抗菌肽活性的方法有很多種，其中定性方法主要是瓊脂擴(kuò)散法、包括濾紙片法、平板打孔法和牛津杯法，三者都是通過抑菌圈的大小來直觀反映其抑菌活性；定量方法主要是酶標(biāo)比濁法和活菌計(jì)數(shù)法。

乳酸鏈球菌素（Nisin）是抗菌肽的典型代表，是已知的具有抗菌作用的一類活性多肽，有研究表明，Nisin能抑制大部分革蘭氏陽性菌（G+菌）及其芽孢的生長繁殖，但對革蘭氏陰性菌（G-菌）、酵母菌和霉菌沒有明顯作用[6-8]。因此，本實(shí)驗(yàn)選取肉制品中常見的3 種革蘭氏陽性腐敗菌：金黃色葡萄球菌、溶血性葡萄球菌和枯草芽孢桿菌為實(shí)驗(yàn)菌，研究多種抑菌率測定方法在評價不同質(zhì)量濃度Nisin抑菌效果時的優(yōu)缺點(diǎn)，旨在為抗菌肽篩選及抑菌作用的評價提供方法學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 菌種、材料與試劑

金黃色葡萄球菌、溶血性葡萄球菌和枯草芽孢桿菌 中國肉類食品綜合研究中心檢測中心實(shí)驗(yàn)室保藏。

乳酸鏈球菌素（Nisin） 青島瑞諾食品配料有限公司；

鹽酸、乙醇、NaCl（分析純） 北京化學(xué)試劑廠；平板計(jì)數(shù)瓊脂、營養(yǎng)肉湯 北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Synergy H4型酶標(biāo)儀 美國伯騰儀器有限公司；PB-10型數(shù)顯酸度計(jì) 賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；SL502N型電子天平 上海民橋精密科學(xué)儀器有限

公司；生物安全柜 新加坡Esco公司；F1-45型恒溫培養(yǎng)箱、G154DWS濕熱滅菌鍋 日本三洋公司。

1.3 方法

1.3.1 菌液的制備

無菌條件下，將甘油保藏的菌種連續(xù)活化2 次。取活化后的新鮮菌液離心棄去營養(yǎng)肉湯，再用無菌營養(yǎng)肉湯將其稀釋至104 CFU/mL備用。

1.3.2 不同質(zhì)量濃度Nisin溶液配制

根據(jù)GB 2760—2011《食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》[9]中對于Nisin使用限量要求，用無菌水配制不同質(zhì)量濃度的Nisin溶液，其質(zhì)量濃度范圍為0.00～0.50 g/L。

1.3.3 瓊脂擴(kuò)散法

1.3.3.1 牛津杯法

牛津杯法又稱為管碟法，是國內(nèi)外測定抗生素效價的通用方法。具體方法為細(xì)菌平板計(jì)數(shù)瓊脂121 ℃、15 min高壓滅菌后倒板，每皿15 mL（下層），凝固后，再將一定濃度的菌懸液與上述培養(yǎng)基（冷卻至45 ℃）混合均勻，加5 mL到已經(jīng)凝固的培養(yǎng)基上（上層）。以無菌操作在培養(yǎng)基表面垂直放上牛津杯（內(nèi)徑6 mm、外徑8 mm、高10 mm的圓形小管），保證其與培養(yǎng)基之間無空隙，再在杯中加入一定質(zhì)量濃度的Nisin溶液100 ?L，以生理鹽水作為對照。每組3 個平板，37 ℃培養(yǎng)24 h后觀察其抑菌圈大小，取平均值。

1.3.3.2 打孔法

參照曾維才等[10]的方法，略作修改。先將滅菌的外徑為8 mm的牛津杯放置在平板中央位置，將一定濃度的菌懸液與滅菌后培養(yǎng)基（冷卻至45 ℃）混合均勻后倒板，均勻倒在牛津杯周圍，每皿15～20 mL。凝固后，用鑷子將牛津杯夾出，則形成直徑8 mm的孔洞，孔內(nèi)注入不同質(zhì)量濃度Nisin溶液100 ?L，以生理鹽水作為對照。每組3 個平板，37 ℃培養(yǎng)24 h后觀察其抑菌圈大小，取平均值。

1.3.3.3 濾紙片法

濾紙折疊為8 層后用打孔器制成直徑6 mm的圓形濾紙片，121 ℃高溫滅菌后干燥備用。滅菌后培養(yǎng)基制成不含菌的平板，待平板凝固后吸取200 ?L菌液均勻涂布于培養(yǎng)基表面。將準(zhǔn)備好的濾紙片置于平板中央，吸取不同質(zhì)量濃度Nisin溶液100 ?L，緩慢滴加于濾紙片上，以生理鹽水作為對照。每組3 個平板，37 ℃培養(yǎng)24 h后觀察其抑菌圈大小，取平均值。

在瓊脂擴(kuò)散法中，一方面添加的菌種在適宜的條件下開始生長繁殖；另一方面，抗菌肽Nisin呈球面擴(kuò)散，即隨著離中心加液位置距離的增加，Nisin質(zhì)量濃度逐漸變小，在最低抑菌質(zhì)量濃度處有一條帶，在這條帶的范圍內(nèi)菌不能生長而成透明的圓圈，即抑菌圈[12-13]。針對同一種抑菌物質(zhì)，其質(zhì)量濃度越大，抑菌圈也越大。本實(shí)驗(yàn)比較了3 種瓊脂擴(kuò)散法測定不同質(zhì)量濃度的Nisin對3種腐敗菌抑制作用時的抑菌圈大小，結(jié)果如表1所示。3種方法均能檢測到Nisin對3種腐敗菌具有一定抑制作用，其強(qiáng)弱順序的結(jié)果一致，均為枯草芽孢桿菌>金黃色葡萄球菌>溶血性葡萄球菌，且Nisin質(zhì)量濃度越大，抑菌作用越強(qiáng)。但3 種方法測定抑制效果時的靈敏度不一致，打孔法的靈敏度最高，當(dāng)Nisin質(zhì)量濃度為0.15 g/L時就可觀察到對金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的抑菌圈；其次為濾紙片法，0.20 g/L Nisin即可表現(xiàn)出抑菌效果；最后是牛津杯法，當(dāng)Nisin質(zhì)量濃度為0.25 g/L時，才能觀察到抑菌圈。瓊脂擴(kuò)散法中Nisin的抗菌作用則受到其在培養(yǎng)基中擴(kuò)散情況的影響，且一定質(zhì)量濃度的Nisin在培養(yǎng)基中擴(kuò)散后，質(zhì)量濃度變小，不易控制，因此一般情況下只用于定性分析。

從抑菌圈的清晰程度和形狀來看，打孔法效果最佳，這可能是因?yàn)榭咕脑诳锥粗信c瓊脂接觸面積大，能夠更充分均勻地擴(kuò)散到培養(yǎng)基中，與目標(biāo)菌相互作用，所得的抑菌圈既規(guī)則又清晰。而牛津杯法在放置牛津杯時力度難以掌握，可能造成牛津杯在培養(yǎng)基表面滑動或抗菌肽滲透擴(kuò)散的不均勻。濾紙片法所得的抑菌圈形狀較規(guī)則，但由于含藥濾紙層全部暴露在空間中，抗菌肽可能會有少部分結(jié)晶析出，造成靈敏度偏低。這與劉春云等[14]的研究結(jié)果相似，但與張慧等[15]之前的結(jié)論有所沖突，這可能是因?yàn)楸緦?shí)驗(yàn)中所用的打孔法經(jīng)過修改，避免了火焰封板相關(guān)的缺點(diǎn)。

2.2 酶標(biāo)比濁法對Nisin抑菌效果的評價

當(dāng)Nisin質(zhì)量濃度小于0.10 g/L時，對3 種腐敗菌沒有起到明顯的抑制作用；在0.10～0.20 g/L范圍內(nèi)，抑菌率隨Nisin質(zhì)量濃度的增加而顯著提高；此后抑菌率隨Nisin質(zhì)量濃度的增加而緩慢提高。在Nisin質(zhì)量濃度為0.15 g/L時，對3種菌均已表現(xiàn)出一定的抑菌作用，可見，用酶標(biāo)比濁法測出的藥物抗菌效力比用瓊脂擴(kuò)散法要大些，這可能與抗菌肽在瓊脂中的滲透性有關(guān)[16]，即抗菌肽在瓊脂中的滲透作用有限，而在液體狀態(tài)下抗菌肽能與目標(biāo)菌作用更充分。

酶標(biāo)比濁法是基于菌懸液濁度與其OD值具有一定相關(guān)性的原理而設(shè)計(jì)的，該方法與傳統(tǒng)分光光度計(jì)測定菌懸液OD值相比具有快速準(zhǔn)確和高通量的優(yōu)點(diǎn)。不僅能減少因菌懸液的沉降而造成的隨機(jī)誤差，且酶標(biāo)板上有96 個小孔可在短時間內(nèi)測定多個樣品[17]。但該方法也具有一定的局限性，如菌液緩沖體系的不均一、不穩(wěn)定，終止時間的控制等細(xì)微變化均會影響測定結(jié)果，致使結(jié)果的重現(xiàn)性較差[18-19]。

2.3 活菌計(jì)數(shù)法對Nisin抑菌效果的評價

Nisin質(zhì)量濃度在0.00～0.15 g/L的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)增加時，對3 種腐敗菌的抑菌率顯著提高，對金黃色葡萄球菌的抑菌率由0.00%提高至86.55%；對溶血性葡萄球菌的抑菌率由0.00%提高至75.21%；對枯草芽孢桿菌的抑菌率由0.00%提高至88.31%。此后抑菌率隨Nisin質(zhì)量濃度的增加而緩慢提高。可見，與酶標(biāo)比濁法相比，活菌計(jì)數(shù)法測定抗菌肽抑菌活性時的靈敏度更高，在較低質(zhì)量濃度時已經(jīng)表現(xiàn)出一定抑菌作用。這可能是因?yàn)榇朔椒z測過程中，Nisin會與目標(biāo)菌在未添加培養(yǎng)基的情況下相互作用一段時間，有相關(guān)研究[20]表明，抗菌物質(zhì)與目標(biāo)菌相互作用時間越長，抑菌率越大。

3 結(jié) 論

實(shí)驗(yàn)選用的金黃色葡萄球菌、溶血性葡萄球菌和枯草芽孢桿菌均為G+菌，且為肉制品中常見的腐敗菌，對研究多種抑菌率測定方法在評價Nisin的抑菌作用時具有一定的代表意義。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果判定，3 種瓊脂擴(kuò)散定性抑菌實(shí)驗(yàn)中，打孔法靈敏度高，抑菌圈清晰，規(guī)則，效果最好，與牛津杯法和濾紙片法滲透擴(kuò)散途徑相比具有一定的優(yōu)越性，是抗菌肽定性分析較理想的方法。2 種定量抑菌實(shí)驗(yàn)中，Nisin與目標(biāo)菌株在液體狀態(tài)下充分混合，Nisin的質(zhì)量濃度容易控制。其中活菌計(jì)數(shù)法的敏感性更高，結(jié)果判定更直觀，效果最好。因此，在抗菌肽抑菌作用評價過程中，采用打孔法定性與活菌計(jì)數(shù)法定量相結(jié)合的方法，能夠更全面、準(zhǔn)確地反應(yīng)其抑菌活性。

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