微生物反硝化及其電化學強化研究進展

（廣州市市政集團有限公司，廣東廣州 510060）お

摘要 微生物反硝化過程是在硝酸鹽還原酶、亞硝酸鹽還原酶、一氧化氮還原酶、一氧化二氮還原酶及其他一些脫氫酶的作用下，將電子供體的電子傳遞給NO3-的過程。在此綜述了反硝化的各種電子供體及各種碳源。根據(jù)碳源的不同，反硝化菌可分為異養(yǎng)型反硝化菌和自養(yǎng)型反硝化菌。針對反硝化的過程，可以通過提供電子供體、加入電子載體、提高酶活性、加速輔酶再生、電刺激提高微生物活性等方法來強化反硝化過程。

關鍵詞 反硝化；電子傳遞；電子供體；BER；電刺激

中圖分類號 SB181.3文獻標識碼

A文章編號 0517-6611（2014）19-06324-03お

The Mechanism of Denitrification and the Enhancement by Electrode

ZHANG Wan瞙ui(Guangzhou Municipal Group Co. Ltd., Guangzhou, Guangdong 510060)

AbstractThe process of denitrification is transfer of electron from donor to receiver, with the catalysis of corresponding nitrate reductase (NAR), nitrate reductase (NIR), nitric oxide reductase (NOR) and nitrous oxide reductase (N2OR). Various electron donors and carbon sources of denitrification were summarized. Denitrification could be separated to heterotrophic denitrification and autorrophic denitrification, according to the difference of carbon source. Various methods to enhance the effect of denitrification were depicted, such as adding electron donor and electron carrier, enhancing the activity of enzyme, accelerating the regeneration of enzyme, adding electrode field and so on.

Key wordsDenitrification; Electron flow; Electron donor; BER; Electrolytic stimulation

作者簡介 張萬輝（1983- ），男，河南開封人，工程師，從事于城鎮(zhèn)環(huán)境化學研究。

收稿日期 20140604

隨著工業(yè)的發(fā)展，硝酸鹽在土壤和水環(huán)境大量富集，現(xiàn)已是世界各國需要面臨的嚴峻的環(huán)境問題［1］。含氮化合物排入到環(huán)境中，會引起水體的富營養(yǎng)化，硝酸鹽對人和動物會產(chǎn)生危害，能引起嬰兒的高鐵血紅蛋白癥［2］。實驗室中動物實驗已證明，硝酸鹽能夠引起心臟和行為問題［3］，且由硝酸鹽轉(zhuǎn)化成的硝酸銨是強致癌物［4］。目前，各國的學者均在致力于脫除飲用水、水產(chǎn)用水和工業(yè)廢水中的硝酸根。脫除硝酸鹽的方法有物理化學法和生物法。離子交換、吸附、化學處理、膜技術和微生物法已廣泛應用，離子交換和吸附法已被應用于生產(chǎn)高純度水，但交換樹脂的吸附容量會迅速飽和，需要不斷地更換和再生［5］。膜技術是一種富集的方法，需要在后續(xù)處理濃縮液，且不適合于低濃度硝酸鹽廢水的處理［6］。微生物反硝化相比于其他的方法更加經(jīng)濟有效。筆者在此綜述了反硝化的各種電子供體及各種┨莢礎＊

1 反硝化的機理

反硝化過程是伴隨著電子傳遞而發(fā)生硝酸鹽還原的生化過程,研究表明硝酸鹽（NO3-）完全還原轉(zhuǎn)化為氮氣(N2)包括以下4個過程［7］，即

㎞O3（+5）→㎞O2（+3）→㎞O（+2）→㎞3O（+1）→㎞2（0）。反硝化過程涉及多種酶和多種中間反應產(chǎn)物并伴隨著電子的傳遞，Park等揭示了這些酶和相關反應如圖1所示［5，8-9］。由NO3-還原成NO2-的過程在細胞膜中進行，其他3個過程均在周質(zhì)中進行。NAR是膜結(jié)合蛋白，在革蘭氏陰性菌種屬于周質(zhì)酶，在反硝化菌細胞內(nèi)存在2種硝酸鹽還原酶，細胞膜內(nèi)側(cè)的膜內(nèi)硝酸鹽還原酶和細胞膜外側(cè)的膜外硝酸鹽還原酶［10-11］。NIR是存在于細胞膜外細胞周質(zhì)中的周質(zhì)酶，有含有c和d1 2種細胞色素的Cyt cd1型和含銅催化中心的Cu型［12］。NOR是位于細胞膜上與膜結(jié)合的細胞色素bc復合物，由2個亞單位Cyt b和Cyt c結(jié)合，該酶含有非血紅素鐵［13］。N2OR是含有2個Cu活性中心同型二聚體的細胞周質(zhì)酶［14］。

注：NAR為硝酸鹽還原酶；NIR為亞硝酸鹽還原酶；NOR為一氧化氮還原酶；N2OR為一氧化二氮還原酶；Cytc為細胞色素；NAD為煙酰胺腺嘌呤二核苷酸；FeS為鐵硫蛋白；CoQ為輔酶Q。

圖1 反硝化的生化反應和電子傳遞

在反硝化過程中，反硝化菌通過電子傳遞體系將電子傳遞給最終電子受體硝酸鹽［15］，反硝化菌細胞膜內(nèi)電子載體的氧化還原電位大小順序依次為NAD+/NADH(-0.320 V)

2 反硝化過程的能量利用

反硝化菌能夠利用有機物、無機物和光能等作為其能量的來源。反硝化的生化反應式為［10］：NO3-+2H++2eNaRNO2-+H2O-89.2 kJ/mol、

NO2-+2H++eNiRNO+H2O-32.9 kJ/mol、

2NO+2H++2eNoRN2O+H2O-226.4 kJ/mol、

N2O+2H++2eN2oRN2+H2O-261.8 kJ/mol。

反硝化菌多數(shù)為兼性厭氧菌，在以硝酸鹽作為電子受體時基質(zhì)釋放的能量會下降，氧化磷酸化僅產(chǎn)生2 mol的ATP［17］。反硝化過程共放出604 kJ的能量，即使這些能量全部轉(zhuǎn)化為ATP，約可產(chǎn)生11.5 mol ATP,屬于低級能源。

3 反硝化類型

反硝化菌是以NO3-作為最終電子受體，將NO3-還原為N2的細菌總稱。根據(jù)對碳素營養(yǎng)物的同化能力的不同分為異養(yǎng)型和自養(yǎng)型反硝化菌，它們的電子供體的反硝化化學反應式如表1所示。

表1 不同碳源的反硝化反應化學反應式

電子供體 化學反應式 參考文獻

CH3OH 1.08CH3OH+NO3- +0.24H2CO3→0.06C5H7O2N +0.47 N2+1.68H2O+HCO3- 18

C2H5OH 0.69C2H5OH+NO3-+H+→0.14C5H7NO2+0.43N2+0.67CO2＋2.07H2O 19

CH3COOH 0.82CH3COOH+ NO3- →0.07C5H7O2N+0.47 N2+0.90H2O+HCO3-+0.30CO2 20

C6H12狾6 0.36 C6H12狾6+NO3-+0.18NH4++0.82H+→0.18C5H7O2N+0.5N2+2.28H2O+HCO3-+1.25CO2 21

S 1.10S+NO3-+0.086NH4++0.76H2O+0.4CO2→0.04C5H7O2N+0.48N2+0.98SO42-+HCO3-+0.96 H+ 22

H2S 0.421H2S+0.421HS-+NO3-+0.346CO2+0.086HCO3-+0.086NH4+→0.086C5H7O2N+0.50N2+0.842SO42-+HCO3-+0.262 H++0.434H2O 23

S2O32- NO3-+0.43H2O+0.35CO2+0.87HCO3-+0.087NH4+→0.087C5H7O2N+0.50N2+1.69SO42-+0.7H+ 5

H2 0.303H2+NO3-+0.23 CO2+H+→0.05 C5H7O2N +0.48 N2 3.37H2O 24

e- 2NO3-+6 H2O+10 e- →N2+12OH- 1

3.1 異養(yǎng)反硝化

異養(yǎng)反硝化菌在缺氧的條件下利用各種有機碳源作為能量和電子供體，主要有假單胞菌（Pseudomonas）、脫氮副球菌（Paracoccus）、產(chǎn)堿菌（Alcaligenes）、黃質(zhì)菌（flavobacterium）和桿菌（Bacillus）等［25］。異養(yǎng)反硝化已經(jīng)應用于資源回收和傳統(tǒng)的污水處理廠。對于市政污水和農(nóng)業(yè)廢水，含有大量的有機碳源，反硝化所需的碳氮比（C/N）很容易滿足，但大量的工業(yè)廢水碳源的含量很低，需要投加碳源滿足反硝化菌的需要。研究發(fā)現(xiàn)，向碳源不足的廢水中投加甲醇、乙醇、乙酸、葡萄糖或淀粉等碳源可以有效地促進反硝化反應［21,26］。但反硝化過程投加的碳源也引起了關注。一些有機碳源是有毒物質(zhì)，反硝化的剩余量將仍然滯留在水中，且一些外加碳源的反硝化的副產(chǎn)物需要作進一步處理［7］。甲醇是現(xiàn)在已知用于反硝化過程最便宜的碳源，目前研究者們致力于研究采用更為廉價的碳源代替甲醇，多種廉價的不溶性碳源用于反硝化，如棉花、麥稈、報紙、鋸末、淀粉和植物油等［27-28］。

3.2 自養(yǎng)反硝化

自養(yǎng)反硝化菌利以CO2、CO和CO32-作為碳源，以H2和硫化物等作為電子供體和能量來源。相比于異養(yǎng)反硝化，自養(yǎng)反硝化避免了一些有機碳源的毒害、較低的污泥和基質(zhì)產(chǎn)生量等優(yōu)點，避免了反應器的堵塞且簡化了預處理?？梢宰鳛殡娮庸w的硫化物有S2-、S、S2O32-、S4O62-和SO32-等，相比于甲醇和乙酸等有機碳源，硫的價格較便宜，且反硝化過程可以降低反硝化的費用［29-30］。

氫氣由于無毒、清潔、在水中的低溶解性且無代謝基質(zhì)等優(yōu)點，已經(jīng)成為一種理想的反硝化電子供體［24］。利用氫氣作為電子受體的反硝化菌主要有Paracoccus菌、Alcaligenes eutrophus菌和Pseudomounas菌等［31-32］，采用氫氣作為電子供體能夠取得較好的反硝化效果。Gentzar采用氫氣代替有機碳作為電子供體，結(jié)果發(fā)現(xiàn)脫氮效果提高了8.5倍［33］。但氫氣在水中的低溶解度（1.6 mg/L,20 ℃）限制了其從氣態(tài)到液態(tài)間的傳質(zhì)速率，從而影響反硝化速率［24］。另外，氫氣是一種危險氣體，容易發(fā)生爆炸，限制了在反硝化過程中的應用［7］。為了克服氫氣的缺點，Sakakibara等開發(fā)了電化學和微生物耦合的方法，微生物電極反應器（BER），在這個系統(tǒng)中微生物利用陰極電解產(chǎn)生的氫氣進行脫氮，研究表明，BER系統(tǒng)能夠取得良好的脫氮效果［34］。研究較多的BER是二維電極和微生物的耦合的方法，三維電極和微生物耦合的方法較少，尤其是單極性三維電極和微生物耦合更少（表2）。Zhou等研究了單極性三維電極微生物反應器，第三極活性炭不僅提供了生物膜和氫氣形成的點位，且其表面能與O2反應產(chǎn)生CO2，創(chuàng)造更好的缺氧環(huán)境，這種BER系統(tǒng)脫氮率可達0.222 mg NO32--N/（cm2·d），電流效率高達227%［35］。在BER系統(tǒng)中，對于電極的作用還沒有一致的意見，普遍認為微生物利用陰極電解產(chǎn)生的H2作為電子供體進行反硝化，Park等認為BER系統(tǒng)中，微生物直接利用陰極的電子進行反硝化，在200 mA電流作用下，硝酸鹽的最大去除速率達0.17 mg NO32--N/（cm2·d）,去除率高達98％［1］。Zhang等認為陰極所在的一區(qū)產(chǎn)生有宜于微生物生長的較低氧化還原電位的環(huán)境，從而加速了微生物的反硝化反應［42］。Beschkov等認為電場作用下微生物反硝化作用提高是電化學和微生物活性兩方面共同的作用［43］。

4 強化反硝化過程

傳統(tǒng)的反硝化過程是在缺氧或厭氧條件下，反硝化菌通過電子傳遞鏈將電子從電子供體傳遞給NO3-，這個過程涉及硝酸鹽還原酶、亞硝酸還原酶、一氧化氮還原酶、一氧化二氮還原酶［10］。不同的研究者針對這個過程，采用不同的方法從不同的角度來提高反硝化過程。Robert等將具有電子傳遞功能的燃料基質(zhì)藏紅T等與NaR、NiR和N2OR等共同固定在陰極表面，發(fā)現(xiàn)酶的活性顯著提高，能將NO3-徹底還原為N2［44］。微生物反硝化過程是由脫氫酶直接參與的電子傳遞過程，如果能夠加速輔酶的再生就能夠提高反硝化的效果，Palmore等采用與NAD+/NADH氧化還原電位接近的聯(lián)芐吡啶作為電子載體，硫辛酰胺脫氫酶催化NAD+的再生，加速了電子的傳遞［45］。輔酶再生的方法有化學法、光化學法、酶法和電化學法，現(xiàn)在輔酶再生方法在發(fā)酵工程和微生物燃料電池方面研究較多，反硝化過程中的研究還鮮有報道。在低電場下，細胞具有更好的通透性，有利于營養(yǎng)物質(zhì)的額吸收，胞外酶的活性變強加速了酶催化反應。宋波研究了Enterobacter dissllven在直流電條件下的生長和代謝過程，發(fā)現(xiàn)在直流電刺激作用下陰極細菌葡萄糖降解率和脫氫酶活性顯著提高［46］。Beschkov等研究了再恒電位下反硝化菌Pseudomonas denitrificans的反硝化過程，發(fā)現(xiàn)電解刺激作用顯著提高了脫氮效率并縮短了細胞生長停滯期的時間［43］。

表2 各種不同類型的BER反應系統(tǒng)

BER類型 陰極 陽極 處理廢水類型 脫氮速率 參考文獻

平行板電極BER 金屬網(wǎng) 鉑電極 反硝化脫氮、排除SS 脫氮速率達16.40 mgN/h ［36］

圓柱型BER 石墨柱 石墨柱 反硝化脫氮 硝酸鹽的去除率高達98％ ［37］

棒狀BER 不銹鋼 石墨棒 反硝化脫氮、中和溶液 實現(xiàn)同時反硝化和去除銅又可調(diào)節(jié)pH ［38］

管型BER 不銹鋼網(wǎng) 不銹鋼 反硝化脫氮 實現(xiàn)同時去除2，4睤CP和重金屬 ［39］

流化床BER 活性炭纖維飲用水反硝化 反硝化速率達0.031 mgN/（cm2·d） ［40］

三維電極BER 活性炭纖維 PbO2 地下水脫氮 0.222 mgNO32--N/（cm2·d） ［35］

旋轉(zhuǎn)電極BER 旋轉(zhuǎn)圓盤 碳素板 反硝化脫氮 脫氮率達100％ ［41］

5 小結(jié)與討論

反硝化過程是一個涉及到在微生物細胞內(nèi)外不同位置各種酶參與作用下，通過電子鏈將電子供體提供的電子傳遞給NO3-的過程。為了提高反硝化的速率，針對反硝化過程不同階段，研究者們從不同的方向著手，如采用適宜的電子供體、直接提供電子、提高酶的活性、加速輔酶的再生、采用電子載體傳遞電子、提高細胞的通透性等來提高反硝化速率。BER系統(tǒng)是微生物和電化學的結(jié)合來提高反硝化的速率，現(xiàn)在研究較多的是二維電極BER系統(tǒng)，三維電極BER研究較少尤其是單極性三維BER系統(tǒng)。采用導電且易掛膜的材料作為第三極的單極性BER應是極具潛力的研究領域，但BER系統(tǒng)強化反硝化的機理還未徹底清楚，需要作進一步的研究。

現(xiàn)在已有學者采用微生物燃料電池來提高反硝化速率，直接利用有機物氧化產(chǎn)生的電子通過電極轉(zhuǎn)移到陰極區(qū)進行微生物反硝化，既提高了反硝化速率又可以節(jié)省電能，此方向是反硝化研究又一新領域。以往的研究只是單純地針對NO3-的反硝化，如果能夠?qū)⒎聪趸^程和難降解有機物共同作為研究對象，同時提高二者去除效果將會更有┮庖?。?/p>

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