松科3種植物抗寒性研究

卿龍

[摘 要] 通過對松科3種植物葉片的可溶性糖含量、脯氨酸含量、自由水與束縛水以及葉綠素含量等指標(biāo)的測定，結(jié)果表明：可溶性糖與脯氨酸含量均隨溫度的自然降低而不斷增加；葉片總含水量較低，而束縛水/自由水較高，葉綠素含量則隨著氣溫的自然降低而減少，但類胡蘿卜素/葉綠素總含量的比值較高；綜合各項指標(biāo)，松科3種植物的抗寒性強弱順序為：樟子松>青海云杉>油松。

[關(guān)鍵詞] 油松 樟子松 青海云杉 葉片 抗寒性

緒論

樟子松（Pinus sylvestris var. mongolicaLitv）、青海云衫（Picea asperata Mast.）和油松（Pinus tabuliformis Carr.）均為松科（Pinaceae）植物，松科是裸子植物中最大的一科，有10屬，230種，主產(chǎn)北半球。我國有10屬113種，分布遍全國，絕大多數(shù)為森林樹種和用材樹種，在東北、華北、西北、西南及華南地區(qū)高山地帶組成大片森林，有些種類可供采脂、提煉松節(jié)油等多種化學(xué)原料，有的種類種子可食或供藥用，有些可作園林綠化樹種。

松科植物的化學(xué)成分較復(fù)雜，其共同的特點是含有樹脂及揮發(fā)油，缺乏生物堿，缺少雙黃酮。樹脂貯存在樹脂道內(nèi)，與揮發(fā)油共存。樹脂中含有多種有機酸（如松香中含有90%以上的樹脂酸），還有樹脂醇、樹脂酯及大量的樹脂烴類。揮發(fā)油含于針葉及樹脂中，揮發(fā)油中含有多種烯類。松科植物種子油中均含有不常見的3種共存的特征脂肪酸，對順-5，9十八碳二烯酸（18：2）、順-5，9，12十八碳三烯酸（18：3）和順-5，11，14，二十碳三烯酸。

目前對松科植物的研容主要集中在：育苗與造林技術(shù)、莖的初生結(jié)構(gòu)比較以及松科植物表皮的電鏡掃描，松科植物的化感活性等方面。

本次試驗針對松科3種植物，在自然降溫過程中抗寒性進(jìn)行研究，測定了游離脯氨酸含量、可溶性糖含量、自由水與束縛水含量以及葉綠素含量這4個指標(biāo)。為進(jìn)一步掌握其生長生理、生態(tài)特性，擴大引種提供理論支持[1]。

一、材料與方法

1.實驗材料

2.試驗方法

2.1 游離脯氨酸含量測定（茚三酮顯色法）

稱取0.2g鮮葉，剪碎置于具塞試管中，加3%的磺基水楊酸溶液5ml，沸水浴中浸10min，冷卻至室溫，取上清液2ml，加2ml冰乙酸和2.5%酸性茚三酮顯色液3ml。沸水浴中顯色40min。冷卻，用5ml甲苯萃取，測定520nm波長下的消光值。

脯氨酸含量（ug/g）=（c*v/a）/w

C：提取液中脯氨酸濃度（ug） v：提取液總體積（ml）

W：植物組織鮮重（g） a：測定時所吸取的體積（ml）

2.2 可溶性糖含量測定（蒽酮法）

稱取0.2g鮮葉，剪碎置于具塞試管中，加10ml蒸餾水于沸水浴中浸1h，提取液過濾入25ml的容量瓶定容，吸取0.2ml提取液加1.8ml蒸餾水，依次加0.5ml蒽酮乙酸乙酯和5ml濃H2SO4于沸水浴中顯色1min，冷卻至室溫后測定630nm波長下的消光值。

可溶性糖含量（%）=（c*v/a*n）/（w*106）

C：標(biāo)準(zhǔn)曲線求得糖量（ug） a：吸取樣品液體積（ml）

V：提取液量（ml） n：稀釋倍數(shù) w：植物組織鮮重（g）

2.3 自由水與束縛水含量測定

2.3.1 植物組織中總含水量的測定

（1）取稱量瓶3只（三次重復(fù)，下同），依次編號并分別準(zhǔn)確稱重。（2）選取生長一致的待測的植物數(shù)株，各選部位、長勢、葉齡一致的有代表性葉子數(shù)片。用剪刀剪取針葉片150片（注意避開粗大的葉脈），立即裝到上述稱量瓶中（每瓶隨機裝入50片），蓋緊瓶蓋并精確稱重。（3）將稱量瓶連同小圓片置烘箱中105℃下烘15min以殺死植物組織細(xì)胞，再于80～90℃下烘至恒重（稱重時須置干燥器中，待冷卻后稱）。設(shè)稱量瓶重量為W1，稱量瓶與小圓片的重量為W2，稱量瓶與烘干的小圓片的重量為W3（以上重量單位均設(shè)為g，下同）。則植物組織的總含水量（%）可按下式計算

植物組織的總含水量（%）=（W2-W3）/（W2-W1）×100

根據(jù)上式可分別求出三次重復(fù)所得到的組織總含水量的值并進(jìn)一步求出其平均值。

2.3.2 植物組織中自由水含量的測定（1）另取稱量瓶3只，編號并分別準(zhǔn)確稱重。（2）用剪刀剪取小葉圓片150片（植物材料的選取同上），立即隨機裝入三個稱量瓶中（每瓶裝50片），蓋緊瓶蓋并立即稱重。（3）三個稱量瓶中各加入60%～65%的蔗糖溶液5ml左右，再分別準(zhǔn)確稱重。（4）各瓶于暗處置4～6h（經(jīng)減壓處理后，只需在暗處置1h），其間不時輕輕搖動。到預(yù)定的時間后，充分搖動溶液。用阿貝折射儀（見附注）分別測定各瓶糖液濃度，同時測定原來的糖液濃度。

設(shè)稱量瓶重量為W1，稱量瓶與小圓片的重量為W2，稱量瓶與小圓片及糖液的重量為W4，糖液原來的濃度為C1，浸過植物組織后的糖液的濃度為C2。則植物組織中自由水的含量（%）可由下式算出：植物組織中自由水的含量（%）=（W4-W2）×（C1-C2）/[（W2-W1）×C2]×100

根據(jù)上式同樣可求出三個不同的測定值并進(jìn)一步求出其平均值。

2.3.3 植物組織中束縛水含量的計算

植物組織中束縛水的含量（%）=組織總含水量（%）-組織中自由水含量（%）

2.4 葉綠素含量測定

2.4.1 取新鮮植物葉片或干材料，擦凈組織表面污物，剪碎，混勻。

2.4.2 稱取剪碎的新鮮樣品0.2g，共3份，分放研缽中，加少量石英砂和碳酸鈣及2ml～3ml96%乙醇，研成勻漿，再加乙醇10ml，繼續(xù)研磨至組織變白。靜置3～5min。

2.4.3 取濾紙一張，置漏斗中，用乙醇潤濕，沿玻棒把提取液倒入漏斗中，過濾到25ml棕色容量瓶中，用少量乙醇沖洗研缽、研棒級殘渣數(shù)次，最后連同殘渣一起倒入漏斗中。

2.4.4 用滴管吸取乙醇，將濾紙上的葉綠體色素全部洗入容量瓶中。直至濾紙和殘渣中無綠色為止，最后用乙醇定容到25ml，搖勻。

2.4.5 把葉綠體色素提取液倒入光徑1cm的比色杯中。以96%乙醇為空白對照，在波長665nm、649nm和470nm下測定光密度。

2.4.6 按公式（1）、（2）、（3）分別計算葉綠素a、b和類胡蘿卜素的濃度（mg·dm-3）。（1）、（2）式相加即得葉綠素總濃度。

2.4.7 求得色素的濃度后再按下式計算組織中各色素的含量（用mg·g-1鮮重或干重表示）；

二、結(jié)果與分析

由圖表2可以看出這3種松科植物的可溶性糖含量的總體趨勢一致，它們均隨著氣溫的自然降低而不斷增加。青海云杉由7月初的10.36%增長到12月中旬的46.63%，樟子松從7月初的13.93%增長到12月中旬的48.17%，油松從7月初的9.66%增長到12月中旬的45.06%，變化無明顯差異。從不同時間的增長幅度看，油松的可溶性糖含量在10月～11月變化最大，從10月的16.4%增加到11月的30.39%，增長率為85.3%，樟子松從10月的19.55%增加到11月的31.91%，增長率為63.22%，青海云杉從10月的19.48%增加到11月的29.37%，增長率為50.77%，11月～12月可溶性糖含量變化，青海云杉和樟子松大致一樣。青海云杉從11月初的29.37%增加到12月初的35.23%最后增加到12月中旬的46.63%，增長率為58.77%；樟子松從11月的31.91%增加到12月初的36.32%最后增加到12月中旬的48.17%，增長率為50.96%；油松從11月的30.39%增加到12月初的35.77%最后增加到12月中旬的45.06%，增長率為48.27%。

2.脯氨酸含量測定

該指標(biāo)下3種植物的抗寒性強弱順序：樟子松>青海云杉>油松。在逆境條件下（旱、鹽堿、熱、冷、凍），體內(nèi)脯氨酸的含量顯著增加。在一定程度上植物體內(nèi)脯氨酸含量反映了植物的抗逆性，抗性強的品種往往積累較多的脯氨酸。由于脯氨酸親水性極強，能穩(wěn)定原生質(zhì)膠體及組織內(nèi)的代謝過程，因而能降低凝固點，有防止細(xì)胞脫水的作用。要想具備最大的抗凍力，在秋的抗寒鍛煉中必將發(fā)生一系列的深刻變化，也是必須經(jīng)過的過程，隨著季節(jié)的變化植物的抗凍力起伏極大，在低溫條件下，植物組織中脯氨酸增加，可提高植物的抗寒性，因此，可作為抗寒育種的生理指標(biāo)。脯氨酸能降低細(xì)胞滲透勢，還可使蛋白質(zhì)束縛更多的水分子。脯氨酸含量總體趨勢隨溫度的自然降低而升高。7月至10月脯氨酸含量樟子松變化較明顯，樟子松從7月的0.1036mg/g增長到10月的0.1955mg/g，增長率為88.715%；青海云杉從7月的0.1393mg/g增長到10月的0.1948mg/g，增長率為42.43%；油松從7月的0.0966mg/g增長到10月的0.164mg/g，增長率為69.77%；10月至11月3種植物的脯氨酸含量均明顯增加，樟子松從10月的0.1955mg/g增長到11月的0.3191mg/g，增長率為63.22%；青海云杉從10月的0.1948mg/g增長到11月的0.2937mg/g，增長率為50.77%；油松從10月的0.164mg/g增長到11月的0.3039mg/g，增長率為85.3%；11月至12月脯氨酸含量增加，樟子松從11月的0.3191mg/g增長到12月初的0.3632mg/g，增長率為13.82%，再增長到12月中旬的0.4817mg/g，增長率為32.63%；青海云杉從11月的0.2937mg/g增長到12月初的0.3523mg/g，增長率為16.63%，再增長到12月中旬的0.4663mg/g，增長率為32.36%；油松從11月的0.3039mg/g增長到12月初的0.3577mg/g，增長率為15.04%，再增長到12月中旬的0.4506mg/g，增長率為25.97%。根據(jù)數(shù)據(jù)可以看出該抗寒指標(biāo)下抗寒性強弱順序：樟子松>油松>青海云杉。

3.葉片的水分狀態(tài)

植物體內(nèi)存在2種狀態(tài)的水分，分為束縛水和自由水，束縛水不可以參與各種代謝過程，但自由水卻具備。一般情況下束縛水含量高則植物的抗逆性就強。

由圖表3、4、5可以看出松科3種植物自由水的含水量隨溫度的下降而減少，青海云杉的自由水含量由11月初的24.38%減少到12月中旬的5.95%，油松從11月的24.38%減少到12月中旬的8.72%，樟子松的自由水含量從11月的21.89%減少到12月中旬的4.87%。葉片含水量也逐漸減少，青海云杉的葉片含水量由11月初的57.18%減少到12月中旬的49.22%，油松從11月的57.35%減少到12月中旬的50.91%，樟子松的葉片含水量從11月的54.73%減少到12月中旬的48.01%。而束縛水含量均上升，青海云杉的束縛水含量由11月初的32.8%增加到12月中旬的43.26%，油松從11月的32.82%增加到12月中旬的42.2%，樟子松的葉片含水量從11月的32.84%增加到12月中旬的43.14%。從束縛水/自由水來看，樟子松的束縛水與自由水比值為8.86，是這3種植物中最高的，從此指標(biāo)看出抗寒性強弱順序：樟子松>青海云杉>油松。

4.葉綠體色素含量的變化

由圖表5可知，低溫條件下，3個樹種的葉綠素總含量較低，在0.27—0.77 mg/g之間，但類胡蘿卜素/葉綠素總含量的比值較高，在0.25—0.87之間，其中青海云杉較低為0.25，最高的樟子松達(dá)0.87，油松居中為0.39，隨著氣溫的降低，3 種松科植物葉片葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素含量均存在一定差異， 總體趨勢均隨溫度的自然降低而降低， 但三者降低幅度不同。青海云衫的葉綠素總含量從11月的1.4mg/g降低到12月中旬的0.77mg/g，油松的葉綠素總含量從0.79mg/g降低到0.41mg/g，樟子松的葉綠素總含量從11月的0.85mg/g降低到12月中旬的0.27mg/g，類胡蘿卜素含量變化不大，類胡蘿卜素/葉綠素比值樟子松的最為明顯，從0.38增長到0.87，油松的從0.35增長到0.39，青海云杉從0.28減少到0.25，由此指標(biāo)看出植物抗寒性強弱為：樟子松>油松>青海云杉

三、討論

松屬樹木因其適應(yīng)性強， 耐干旱貧瘠， 能耐-60℃的低溫或50℃的高溫等特點，適合北半球的生長環(huán)境 [2]。青海云杉林天然分布于甘肅、寧夏、內(nèi)蒙古等省，青海省水平分布廣闊，分布區(qū)大致位于北緯38°35′—34°55′；東經(jīng)98°20′—102°25′，面積約占全省針葉林總面積的44%。油松林在青海省主要分布在大通河、湟水、黃河的河谷地帶，大致位于北緯35°32′—37°09′；東經(jīng)101°37′—103°34′。取樣地點位于青海西寧城北區(qū)二十里鋪，海拔2232m， N：36°38′08″，E：101°44′12″。

1.可溶性糖含量的變化 由圖表1可以看出松科3種植物的可溶性糖含量隨溫度的自然降低而增加，這一點與蔡仕珍等的研究結(jié)果一致[3-4]?？扇苄蕴窃诘蜏孛{迫時的積累可提高細(xì)胞滲透壓， 從而增強保水能力。糖還具有冰凍保護(hù)劑用， 防止蛋白質(zhì)在結(jié)冰和解凍時發(fā)生凝固變性[5]?？扇苄蕴亲鳛闈B透保護(hù)物質(zhì)，可提高細(xì)胞液的濃度，增加細(xì)胞持水力及組織中非結(jié)冰水，從而降低細(xì)胞質(zhì)的冰點，是植物抵御低溫的重要保護(hù)性物質(zhì)。當(dāng)植物體受到低溫脅迫或溫度的自然降低時，體內(nèi)的可溶性糖含量就會增加，來保護(hù)植物體不受到傷害，抗寒性越強的品種可溶性糖含量增加得越多。

2.脯氨酸含量 脯氨酸（Proline）是最重要的有機滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)。幾乎所有的逆境，如干旱、低溫、高溫、營養(yǎng)不良、病害和大氣污染等都會造成植物體內(nèi)脯氨酸的積累[6]。脯氨酸是一種親水性氨基酸，能緩解因低溫脫水造成的滲透脅迫[7]。脯氨酸具有較強的水合能力，在植物逆境脅迫下， 是一種滲透保護(hù)劑。在植物受低溫脅迫時，脯氨酸的增加有助于細(xì)胞或組織的保水，同時還可作為碳水化合物的來源、酶和細(xì)胞結(jié)構(gòu)的保護(hù)劑。脯氨酸的這種提高植株耐受脅迫的功能，可能是通過保保護(hù)植物中線粒體電子傳遞鏈，誘導(dǎo)保護(hù)蛋白、泛素、抗氧化酶和脫水素等保護(hù)物質(zhì)的含量增加，啟動相應(yīng)的抗脅迫代謝途徑而實現(xiàn)的[8]。正常情況下，植物體內(nèi)脯氨酸含量并不高，但遭受低溫脅迫后體內(nèi)的脯氨酸含量往往增加，因此可作為植物抗寒性的重要測定指標(biāo)[9]。從圖表2可以看出，脯氨酸含量隨著溫度的自然降低而增加，由圖表3數(shù)據(jù)顯示，樟子松的脯氨酸含量從7月的0.1036mg/g增長到12月中旬的0.4817mg/g，油松從7月的0.0966mg/g增長到12月中旬的0.4506mg/g，青海云杉從7月的0.1393mg/g增長到12月中旬的0.4663mg/g。反映了植物在一定程度上的受害程度，以及植物對低溫脅迫的忍耐及抵抗能力。水溶性最大的氨基酸是脯氨酸，脯氨酸在植物的滲透調(diào)節(jié)中起重要作用，其水溶液具有很高的水勢，具有很強的水合能力。脯氨酸溶液即使在含水量很低的細(xì)胞內(nèi)，仍能維持正常的生命活動，提供足夠的自由水。

3.水分狀態(tài) 自由水含量隨溫度的自然降低而減少，束縛水含量增加，從束縛水/自由水來看，樟子松的束縛水與自由水比值為8.86。植物體內(nèi)的水分以自由水和束縛水2種狀態(tài)存在，自由水可以參與各種代謝過程，而束縛水不能，其作用在于穩(wěn)定原生質(zhì)的結(jié)構(gòu)。一般認(rèn)為自由水含量高，植物代謝活動旺盛，束縛水含量高，表明抗性強[10]。束縛水含量較高，組織K+和可溶性糖都較高.但不同樹種間仍有較大差異，束縛水/自由水比值高，束縛水多而自由水非常少，低溫時少量的自由水容易撤退到細(xì)胞外，而束縛水不能結(jié)冰卻可以穩(wěn)定細(xì)胞質(zhì)，致使細(xì)胞內(nèi)可結(jié)冰的水非常少，所以雖然溶質(zhì)（可溶性糖和K+）較少，但冰點仍會很低，所以耐凍性很強。細(xì)胞內(nèi)大量累積可溶性溶質(zhì)（可溶性糖、氨基酸、K+等） ， ABA 大量合成，植物生長停止、進(jìn)入休眠，抗寒性大大提高[11]。

4.葉綠體色素含量 松樹一般在冬天應(yīng)是綠色，屬常綠越冬植物，但油松、青海云杉和樟子松的針葉部分發(fā)黃，尤以樟子松最為明顯；由表5可知，3個樹種均擁有較高的類胡蘿卜素含量，從類胡蘿卜素/葉綠素比值看，樟子松的最大，說明樟子松在這3種松科植物中抗寒性最強。胡蘿卜素除了可以吸收光能用于光合作用外， 還是植物體內(nèi)的保護(hù)物質(zhì)，可以清除逆境或衰老過程中累積的自由基和活性氧[12-14]。

植物材料在測定植物抗寒力時常常是離體的，且只能是溫度影響它，而在自然界植物的生長是受到多種生物因子和環(huán)境因子的綜合作用，所以對植物抗寒力評估時必須要考慮到其抗寒力也必然受到溫度以外的其他因子影響這個因素[15]。

四、結(jié)論

通過對松科3種植物葉片的可溶性糖含量、脯氨酸含量、自由水與束縛水以及葉綠素含量等指標(biāo)的測定，結(jié)果表明：

1.脯氨酸含量隨著溫度的自然降低而增加，在該指標(biāo)下抗逆性強弱順序：樟子松>油松>青海云杉。

2.自由水隨著植物抗寒性增強而減少，束縛水增加，該指標(biāo)下抗寒性強弱順序：樟子松>青海云杉>油松。

3.可溶性糖隨植物的抗寒性增強而增加，該指標(biāo)下3種植物的抗寒性強弱順序：樟子松>青海云杉>油松。

4.葉綠素含量隨溫度的自然降低而減少，類胡蘿卜素含量較穩(wěn)定。此指標(biāo)下植物抗寒性強弱為：青海云杉>油松>樟子松。

綜合各項指標(biāo)，松科3種植物的抗寒性強弱順序為：樟子松>青海云杉>油松。

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致 謝

本次試驗和撰寫論文的過程中，非常感謝韋梅琴老師對我的精心指導(dǎo)和幫助，以及同學(xué)給予的幫助。在論文完成之際，謹(jǐn)向韋老師致以崇高的敬意和衷心的感謝。感謝農(nóng)林系的各位老師對我這四年來的辛勤栽培。謝謝大家！