禽流感病原學(xué)研究進(jìn)展

田偉等

摘 要：禽流感（avian influenza， AI）是由A型禽流感病毒（avian influenza virus， AIV）引起的一種禽類的感染疾病綜合征。本文通過(guò)對(duì)禽流感病毒的結(jié)構(gòu)和分子生物學(xué)特征等的描述，為H5N1禽流感病毒致病機(jī)理的認(rèn)識(shí)及臨床診斷提供幫助。

關(guān)鍵詞：H5N1；禽流感病毒

1997年之前，盡管人和其他靈長(zhǎng)類動(dòng)物可人工感染禽流感病毒，但在這些宿主體內(nèi)禽流感病毒的復(fù)制受到很大限制，使人們一直認(rèn)為禽流感病毒在自然界不能跨越種間屏障直接感染人類，自1997年首次發(fā)現(xiàn)禽流感病毒感染人后，禽流感的公共衛(wèi)生意義發(fā)生了質(zhì)的改變，禽流感成為一種能引起人類感染的新型傳染病，其傳播對(duì)人類健康造成巨大威脅[1]。

A型流感病毒的致病性與毒株和宿主均有很大關(guān)系，不同毒株對(duì)同一宿主或同一毒株對(duì)不同宿主的致病性差異很大，根據(jù)毒力強(qiáng)弱將禽流感病毒劃分為無(wú)致病性、低致病性禽流感 （low pathogenic avian influenza， LPAI）和高致病性禽流感（highly pathogenic avian influenza， HPAI）。低致病性禽流感病毒病原體從禽類等宿主傳播給雞和鴨等易感家禽后，再經(jīng)若干次循環(huán)感染，就可能發(fā)生一系列突變而轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂袊?yán)重致死性的高致病性禽流感病毒，至今高致病性禽流感病毒包括H7和H5亞型中的部分毒株，由于其傳染性極強(qiáng)，可引起家禽全身性感染，造成多個(gè)組織器官嚴(yán)重病理?yè)p傷，致死率可達(dá)100%[2]。

1 禽流感病毒分類

禽流感病毒在病毒分類學(xué)上屬單股負(fù)鏈RNA病毒目（mononegviralles）正黏病毒科（othomyxoviridae）A型流感病毒屬（influenza virus A）。根據(jù)核蛋白（NP）和基質(zhì)蛋白（MP）差異，將流感病毒共分為3個(gè)型，即A、B和C型，每個(gè)型內(nèi)的毒株都有基本相同的NP和MP，也就是說(shuō)NP和MP具有特異性。A型病毒感染人、豬、馬、海豹、水貂、鯨及所有禽類；B型病毒僅感染人類；C型病毒只感染人和豬。A型和B型流感病毒基因包括8條RNA片段，而C型流感病毒包括7條RNA片段。A型流感病毒是唯一感染禽類的病毒型。

根據(jù)流感病毒血凝素（HA）和神經(jīng)氨酸酶（NA）差異，可將A型流感病毒分為不同亞型。迄今為止，HA已發(fā)現(xiàn)16種，NA有9種，分別以H1～H16、N1～N9表示。它們之間可發(fā)生隨機(jī)組合，從而形成許多不同亞型。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的流感病毒亞型至少有80余種，其中高致病性亞型主要是H5和H7。

2 禽流感病毒的形態(tài)和結(jié)構(gòu)

禽流感病毒的形態(tài)和結(jié)構(gòu)具有多形性，典型的禽流感病毒粒子在電鏡下呈長(zhǎng)絲狀或球形，而感染人的H5N1病毒主要呈球形，長(zhǎng)絲狀少見。禽流感病毒多形性是一種遺傳特征，經(jīng)雞胚或MDCK細(xì)胞培養(yǎng)物連續(xù)傳代后多呈球形，直徑為80～120nm，平均為100nm。禽流感病毒由囊膜和核衣殼構(gòu)成，在囊膜表面有許多放射狀排列的纖突，通過(guò)負(fù)染技術(shù)在電子顯微鏡下可明顯看到表面纖突分為兩類，一類呈棒狀，由血凝素分子的三聚體構(gòu)成；另一類呈蘑菇狀，由神經(jīng)氨酸酶分子的四聚體構(gòu)成。兩種纖突在囊膜上的比例為75∶20。病毒粒子的中心有一直徑為40～60 nm的電子密度高的錐狀核心。基質(zhì)蛋白是病毒粒子內(nèi)的主要蛋白成分，其形成的基質(zhì)膜緊貼在類脂雙層內(nèi)面，包圍著核衣殼，是維持病毒形態(tài)的結(jié)構(gòu)蛋白。禽流感病毒的核衣殼呈螺旋對(duì)稱，核酸為單股負(fù)鏈RNA，分為不同的8個(gè)片段。在核酸外面包被著螺旋排列的殼粒，主要由NP構(gòu)成[3]。

3 禽流感病毒的分子生物學(xué)特征

禽流感病毒屬于正黏病毒科，A型流感病毒，是有囊膜，多形態(tài)的單股負(fù)鏈 RNA病毒?；蚪M分為8個(gè)節(jié)段，由大到小依次為PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M、NS，基因組序列長(zhǎng)度如圖1，每個(gè)RNA片段的5末端均有13個(gè)高度保守的核苷酸，即3-GGAACAAAGAUGAppp-5，3末端有12個(gè)保守核苷酸，即 3-OHUCGUUUUCGUCC-5。在這些共有序列中，可部分互補(bǔ)，形成鍋柄環(huán)狀結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)是病毒RNA聚合酶結(jié)合所必需的核苷酸識(shí)別位點(diǎn)。A型流感病毒共編碼11種病毒蛋白，其中8種是病毒的組成成分（HA、NA、NP、M1、M2、PB1、PB2和PA），另外長(zhǎng)度最小的NS基因編碼是兩個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白NS1和NS2，還有病毒粒子外的脂質(zhì)囊膜伸出許多纖突，包括HA和NA兩種糖蛋白，也是病毒主要的表面抗原[2]。

HA是構(gòu)成病毒囊膜纖突的主要成分之一，是典型的I型糖蛋白，以二聚體形式存在于囊膜表面，其一級(jí)結(jié)構(gòu)有4個(gè)結(jié)構(gòu)域，分別為信號(hào)肽（又叫前導(dǎo)序列）、胞漿域、跨膜區(qū)和胞外域。HA蛋白在病毒吸附和穿膜過(guò)程中起關(guān)鍵作用，被蛋白酶水解為HA1和HA2后，帶有高度保守融合序列的HA2與細(xì)胞質(zhì)膜發(fā)生融合，引發(fā)病毒復(fù)制（楊志剛等，2005）。HA 蛋白也是AIV中最重要的保護(hù)性抗原，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性抗體（Sturm et al.，2004； 陳化蘭等，2004），目前HA的4～5個(gè)抗原表位已經(jīng)被確認(rèn)，且大多都集中在HA1上（Wiley， et al.，1981； Kaverin et al.，2002）。另外，HA在病毒吸附及穿膜過(guò)程中以及決定病毒致病力方面均起關(guān)鍵作用，它能否被裂解為HA1和HA2是病毒感染細(xì)胞的先決條件，也是決定病毒致病力高低的重要因素，如HA易于被切割，則毒株有較強(qiáng)致病力，反之則較低。此外，HA在決定病毒宿主特異性方面也起重要作用，這與病毒粒子HA受體結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)有關(guān)[3]。

NA是鑲嵌在病毒雙層類脂膜上的另一種表面糖蛋白，是病毒重要的表面抗原。其主要作用是水解呼吸道細(xì)胞表面特異性糖蛋白末端的唾液酸殘基，將病毒顆粒從細(xì)胞受體上釋放出來(lái)，幫助子代病毒離開細(xì)胞進(jìn)一步擴(kuò)散傳播。此外NA對(duì)其周圍HA的切割能力也有影響，從而在一定程度上影響病毒的致病性（曹梅，2005）。有研究表明（Hideo et al.， 1998），NA還可通過(guò)連接和隔離纖維蛋白酶原，提高該泛在性蛋白酶前體的局部濃度，從而提高裂解性，增強(qiáng)病毒的侵襲力[3]。

NP是構(gòu)成AIV核衣殼的主要成分，具有型特異性，主要決定宿主范圍（Swayne et al.， 1998），還在病毒基因組的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制中起重要作用，是一種單體磷酸化的多肽，也是構(gòu)成病毒核衣殼的主要成分，與基因組RNA一起構(gòu)成核酸核質(zhì)體（RNP），然后與RNA聚合酶共同構(gòu)成病毒的核心部分。該蛋白具有型特異性，是流感病毒劃分為A、B、C型的主要基礎(chǔ)。同時(shí)其具有多種功能，除了形成病毒核衣殼外，在病毒基因組的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制以及決定病毒的宿主特異性方面均有重要作用。NP還是細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL）的識(shí)別靶位（Lee et al.， 2004），成為誘導(dǎo)機(jī)體免疫保護(hù)性的一個(gè)研究目標(biāo)，但用體外合成的NP免疫動(dòng)物，卻只能產(chǎn)生微弱的抗病毒感染能力[3]。

基質(zhì)蛋白（M）可分為Ml和M2，屬非糖基化蛋白。其中Ml位于病毒囊膜的類脂雙層內(nèi)側(cè)、核衣殼的外側(cè)，是維持病毒形態(tài)的結(jié)構(gòu)蛋白，具有特異性，能夠參與調(diào)控病毒的轉(zhuǎn)錄和被感染細(xì)胞的胞核與胞漿間的物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)。在病毒感染宿主細(xì)胞后期，能抑制轉(zhuǎn)錄酶活性，減少mRNA的合成，使聚合酶復(fù)合物的生物活性幾乎完全轉(zhuǎn)向基因組RNA的合成。M2是一種跨膜蛋白，以四聚體形式存在于感染細(xì)胞的細(xì)胞膜上，其在HA合成過(guò)程中作為質(zhì)子通道控制高爾基體內(nèi)pH，在病毒脫殼時(shí)酸化病毒粒子的內(nèi)部環(huán)境[3]。

非結(jié)構(gòu)蛋白（NS）分為NS1和NS2，是A型流感病毒的兩種非結(jié)構(gòu)蛋白，它們大量存在于被感染細(xì)胞的胞核和胞漿內(nèi)，而不屬于病毒粒子的蛋白成分。序列分析發(fā)現(xiàn)，NS1和NS2有70個(gè)氨基酸的重疊，并且在氨基端有9個(gè)氨基酸是相同的。NS1蛋白為結(jié)合蛋白，具有抑制帶有poly（A）結(jié)構(gòu)的mRNA從細(xì)胞核內(nèi)向外運(yùn)輸?shù)墓δ埽⊿ekellick et al.， 2000），并與宿主細(xì)胞核內(nèi)的蛋白質(zhì)相互作用，執(zhí)行核內(nèi)RNA向外運(yùn)輸?shù)墓δ?。NS2主要在晚期感染的胞漿中[3]。

多聚蛋白酶蛋白（PB1、PB2和PA）在氨基酸序列上有著共同特點(diǎn)，即都具有一個(gè)特異的親核序列區(qū)，其作用是使這幾種蛋白質(zhì)在胞漿合成后能順利進(jìn)入細(xì)胞核。這3種聚合酶在功能上各有分工，其中PA是構(gòu)成RNA聚合酶復(fù)合體，并參與RNA復(fù)制；PB1是在病毒 mRNA 合成起始后使之逐漸延長(zhǎng)；PB2是在病毒mRNA轉(zhuǎn)錄的起始階段發(fā)揮作用，識(shí)別并結(jié)合在5'端I型帽狀結(jié)構(gòu)上（Davis et al.，1993），同時(shí)還有限制內(nèi)切酶活性，參與宿主mRNA 帽狀結(jié)構(gòu)的切割（Naffakh et al.，2000；Shinya et al.， 2004）。通過(guò)對(duì)1997年香港H5N1型AIV（Hatta et al.， 2001）和2003年荷蘭人源 H7N7 型AIV（Fouchier et al.， 2004）PB2蛋白的分析發(fā)現(xiàn)，這些毒株的627位氨基酸與它們對(duì)哺乳動(dòng)物的親嗜性有關(guān)[3]。

AIV可引起大多數(shù)家禽、野禽及水禽的感染，其中以雞和火雞最為易感，水禽則為流感病毒的自然宿主。禽流感病毒亞型眾多，不同亞型病毒之間可通過(guò)交換某些基因片段發(fā)生基因重排，出現(xiàn)具有新的生物學(xué)特征的病毒，而且其抗原變異極為頻繁，主要包括由點(diǎn)突變引起的抗原漂移（antigenic drift）和不同亞型毒株同源重組產(chǎn)生新亞型所引起的抗原轉(zhuǎn)變（antigenic shift），這為禽流感的有效防制帶來(lái)了極大的困難和挑戰(zhàn)。因此病原學(xué)的研究對(duì)于發(fā)現(xiàn)禽流感病毒的致病機(jī)理與診斷有重要意義[3]。

（編輯：郭遠(yuǎn)）

參考文獻(xiàn)：

[1] 索永兵. H5N1亞型禽流感病毒DKFJ/01/02株分子生物學(xué)特性研究及反向遺傳操作系統(tǒng)的建立[G]. 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士論文. 2008.

[2] 陳威. H5N1流感病毒感染雛鴨免疫器官TGF-β1mRNA表達(dá)與免疫功能抑制[G]. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士論文. 2008.

[3] 顏焰. 鵝H5亞型禽流感病毒HA1-iELISA抗體檢測(cè)技術(shù)研究[G]. 新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士論文. 2007.