成骨不全癥體外膠原合成的實(shí)驗(yàn)研究

李虎　韓金祥　王延宙等

摘要：目的 探討1例成骨不全癥患者膠原合成的特征。方法 應(yīng)用3H-脯氨酸摻入法及Elisa法分別檢測成骨不全癥及發(fā)育性髖關(guān)節(jié)脫位兩種來源的皮膚成纖維細(xì)胞的膠原合成及分泌情況。結(jié)果與結(jié)論 與發(fā)育性髖關(guān)節(jié)脫位組相比成骨不全癥患兒細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞外膠原含量顯著降低（P<0.05），提示該例成骨不全患者膠原合成的異常。

關(guān)鍵詞：成骨不全癥；成纖維細(xì)胞；膠原合成

成骨不全癥（Osteogenesis Imperfecta， OI）是一種膠原合成代謝異常引起的結(jié)締組織疾病，臨床上常以骨質(zhì)疏松和骨的脆性增加，藍(lán)鞏膜，牙本質(zhì)形成不全，早熟性耳硬化為診斷標(biāo)準(zhǔn)，群體發(fā)病率約為1/15，000～25，000[1]，其中約90%的患者系I型膠原合成基因COL1A1及COL1A2突變所致[2]。成骨不全患者膠原代謝的研究已成為間接揭示該病發(fā)病機(jī)制的重要方面，本文在體外培養(yǎng)成骨不全癥患者成纖維細(xì)胞的基礎(chǔ)上定量分析其膠原合成的特征。

1 資料與方法

1.1一般資料 經(jīng)山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院倫理委員會批準(zhǔn)并經(jīng)患者及家屬知情同意后，本實(shí)驗(yàn)室在山東省立醫(yī)院收集實(shí)驗(yàn)組成骨不全癥患者及對照組發(fā)育性髖關(guān)節(jié)脫位患者（Developmental dislocation of the hip，DDH）各一例大腿外側(cè)皮膚標(biāo)本，同時調(diào)查了患者信息。患者，男，8歲，因"反復(fù)四肢骨折8年"入院，出生時即左側(cè)股骨中段骨折，此后因翻身、學(xué)走路等反復(fù)骨折8次，父母非近親婚配，家族中均無此類骨折史。查體：身高110cm，體重26kg，雙鞏膜藍(lán)色，牙齒易碎，桶狀胸，其它未見異常。X線片示：各長骨骨干細(xì)長，骨皮質(zhì)變薄，雙側(cè)股骨彎曲畸形。根據(jù)病史、臨床表現(xiàn)及X線結(jié)果診斷為成骨不全癥。發(fā)育性髖關(guān)節(jié)脫位患者與其性別、年齡一致，未患有其它疾病。

1.2主要儀器及試劑 SN-6930型液態(tài)閃爍計(jì)數(shù)器（上海核所日環(huán)光電有限公司），ZFV型微量多頭細(xì)胞樣品收集器（上海醫(yī)科大學(xué) 浙江紹興東浦醫(yī)療儀器廠），L-[2，3-3H]-Proline（中國同輻股份有限公司），DMEM培養(yǎng)基（Gibco），胎牛血清（Gibco），胰酶細(xì)胞消化液（碧云天），人I型膠原酶聯(lián)免疫定量檢測試劑盒（美國R&D System公司），胃蛋白酶（Sigma），BCA蛋白定量試劑盒（貝博生物），非均相閃爍液（2.5g PPO，0.2g POPOP，100ml 無水乙醇，二甲苯補(bǔ)足至500ml），β-氨基丙腈（Sigma），L-抗壞血酸（Sigma）。

1.3方法

1.3.1成纖維細(xì)胞體外培養(yǎng) 用胰蛋白酶消化法分別培養(yǎng)兩種來源成纖維細(xì)胞，無菌條件下漂洗剪碎組織，消化下成纖維細(xì)胞后，轉(zhuǎn)移至含10%胎牛血清的DMEM中，于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待接近完全貼壁后用胰酶消化傳代，取第四代作為實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞。

1.3.23H-脯氨酸摻入實(shí)驗(yàn) 兩組細(xì)胞每組6個副孔，以2.5×104個/0.5ml接種于24孔培養(yǎng)板培養(yǎng)過夜至接近完全貼壁，更換含有100μg/mlβ-氨基丙腈、50μg/ml L-抗壞血酸的DMEM無血清培養(yǎng)基，37℃，5%CO2預(yù)培養(yǎng)30min后，于每孔內(nèi)分別加入1μci 3H-脯氨酸，繼續(xù)培養(yǎng)24h。用胃蛋白酶消化法檢測細(xì)胞分泌至培養(yǎng)液中膠原含量[3]，細(xì)胞內(nèi)膠原含量測定采用胰酶消化，PBS清洗，多頭細(xì)胞樣品收集器收集于玻璃纖維濾膜上并依次用PBS，5%TCA和無水乙醇洗滌固定細(xì)胞后將其置于閃爍瓶，每瓶加入5ml閃爍液，液相閃爍計(jì)數(shù)儀上測定CPM值?？偰z原合成量為細(xì)胞內(nèi)及分泌至培養(yǎng)液中膠原含量之和，另以相同條件下培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，膠原合成結(jié)果用細(xì)胞數(shù)進(jìn)行校正（cpm/103細(xì)胞）。

1.3.3人I型膠原酶聯(lián)免疫定量檢測 兩組細(xì)胞每組3個副孔，以105個/2ml 接種于六孔板培養(yǎng)過夜至接近完全貼壁，更換含50μg/ml L-抗壞血酸的DMEM無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h，收集細(xì)胞及培養(yǎng)液上清用于I型膠原酶聯(lián)免疫測定，同時對細(xì)胞裂解液進(jìn)行總蛋白定量。測定結(jié)果以每微克細(xì)胞總蛋白中細(xì)胞內(nèi)外I型膠原總含量進(jìn)行比較（pg/μg總蛋白）。

2 統(tǒng)計(jì)及分析

所得資料用t檢驗(yàn)進(jìn)行比較分析。

3 結(jié)果

3.13H-脯氨酸摻入值比較 細(xì)胞內(nèi)、細(xì)胞外及總膠原含量比較，OI組成纖維細(xì)胞3H-脯氨酸摻入值明顯低于DDH對照組，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)比較有顯著性差異（P<0.05），見表1。

3.2I型膠原含量比較 每微克細(xì)胞總蛋白中I型膠原總含量進(jìn)行比較可見，OI組細(xì)胞合成及分泌I型膠原總含量明顯低于DDH對照組（P<0.05），見圖1。

4 討論

COL1A1及COL1A2分別編碼產(chǎn)生組成I型膠原的兩條α1鏈及一條α2鏈，兩者突變均可導(dǎo)致I型膠原合成異常。根據(jù)Sillence分型標(biāo)準(zhǔn)可將此類突變的患者歸為I-IV型，本例患者出生后多次骨折致股骨畸形，藍(lán)鞏膜，牙本質(zhì)發(fā)育不全，考慮為IV型成骨不全患者，其病因?yàn)镃OL1A1或COL1A2突變所致，因此膠原合成能力可能存在不同程度異常。脯氨酸在I型膠原中占有一定比例，其摻入多少可反映皮膚成纖維細(xì)胞膠原合成的情況，作為研究膠原合成的常用方法其效果穩(wěn)定、可信。膠原在細(xì)胞內(nèi)合成后膠原前體后，分泌到細(xì)胞外轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒炷z原，進(jìn)一步交聯(lián)聚合成三螺旋結(jié)構(gòu)，由于不同來源細(xì)胞合成蛋白能力往往有所不同，因此應(yīng)用Elisa法定量I型膠原后通過細(xì)胞總蛋白含量進(jìn)行校正可真實(shí)反映不同來源細(xì)胞膠原合成能力。發(fā)育性髖關(guān)節(jié)脫位目前尚無明確結(jié)論證實(shí)其膠原合成異常，因此作為本病對照可提供膠原代謝方面的參考[4]。

Cabral等[5]在蛋白水平對特定位點(diǎn)突變的成骨不全患者膠原合成方面的研究顯示：患者膠原合成量減少，嚴(yán)重者膠原結(jié)構(gòu)異常。本文在細(xì)胞水平對比研究了成骨不全來源的成纖維細(xì)胞膠原合成情況，與國外研究結(jié)論一致。兩種方法的結(jié)果都反映出該例患者膠原合成能力下降，這也與其由于I型膠原合成減少導(dǎo)致的藍(lán)鞏膜、多發(fā)骨折等臨床病征一致。

另外，本研究僅對一例特定分型的成骨不全患者細(xì)胞水平的膠原合成情況進(jìn)行了定量對比研究，有學(xué)者對大量樣本的回顧分析認(rèn)為I型膠原三螺旋區(qū)域不同位置、不同類型突變與其表型有一定相關(guān)性[6]，而在體外細(xì)胞膠原合成水平是否有一定的關(guān)系尚需大量樣本的深入研究。

參考文獻(xiàn)：

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[5]Cabral W A， Makareeva E， Colige A， et al. Mutations near amino end of α1 （I） collagen cause combined osteogenesis imperfecta/Ehlers-Danlos syndrome by interference with N-propeptide processing[J]. Journal of Biological Chemistry， 2005， 280（19）： 19259-19269.

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