慢性氟中毒誘發(fā)大鼠肝臟損傷機(jī)制的研究

蒙光義　王冬曉　王緝義等

摘要：目的 探討氟化鈉慢性中毒對大鼠肝臟生化功能的影響及其相關(guān)機(jī)理。方法 通過給大鼠自由飲用含有不同劑量氟化鈉自來水3個月，制備慢性氟中毒模型，測定其血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）和谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）活性水平，同時檢測各組大鼠肝臟總抗氧化能力（T-AOC）、丙二醛（MDA）含量以及超氧化物歧化酶（SOD）活力和谷胱甘肽（GSH）的活力含量。結(jié)果 氟化鈉慢性中毒各組尿氟和血氟含量均比正常對照組增高（P<0.01），并且中、高劑量組大鼠血清ALT、AST活性增高（P<0.01）；氟化鈉各組大鼠肝臟MDA含量均顯著高于正常對照組（P<0.01），S0D和T-AOC活性顯著下降（P<0.01），同樣中、高劑量組GSH含量活性顯著下降（P<0.01）。結(jié)論 氟化鈉慢性中毒能夠引起肝臟損傷，氧化應(yīng)激引起的氧化損傷作用可能是氟致大鼠肝損傷的重要原因之一。

關(guān)鍵詞：氟化鈉；慢性中毒；肝損傷；氧化應(yīng)激；脂質(zhì)過氧化；大鼠

長期以來，氟中毒主要損害牙齒、骨骼等骨性組織已十分明確，而對內(nèi)臟的損害卻未能引起臨床學(xué)和病理學(xué)醫(yī)生的重視。氟是機(jī)體重要的微量元素之一，但攝入過量能引起廣泛的全身性病變，其作用機(jī)理至今尚不清楚。隨著自由基醫(yī)學(xué)的發(fā)展，人們越來越多的發(fā)現(xiàn)自由基與許多疾病的發(fā)生密切相關(guān)。研究表明，造成肝臟組織損傷是氟中毒引起的非骨相損害的重要靶器官之一，人群流行病學(xué)調(diào)查和動物實(shí)驗(yàn)均表明氟中毒可引起肝臟組織結(jié)構(gòu)和功能異常[1]，其損傷機(jī)制目前尚不明確。大量研究結(jié)果表明，氧化應(yīng)激在氟中毒對機(jī)體的損傷中起著重要作用[2，3]，機(jī)體慢性氟中毒時內(nèi)臟組織病理損傷可能與氟誘導(dǎo)機(jī)體脂質(zhì)過氧化作用增強(qiáng)有關(guān)[4]，但脂質(zhì)過氧化在氟中毒肝臟損傷中的作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)通過制備大鼠氟化鈉慢性中毒模型，檢測氟中毒大鼠血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶（GPT）和谷草轉(zhuǎn)氨酶（GOT）的活性，并觀察肝臟脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）活性以及總抗氧化能力（T-AOC）和谷胱甘肽（GSH）含量的變化，進(jìn)一步探討肝損傷與脂質(zhì)過氧化之間的關(guān)系，為深入研究氟中毒肝臟病變提供科學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物 Wistar大鼠，SPF級，雌雄各半，體重（100±10）g，由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，實(shí)驗(yàn)動物使用許可證號：SYKG桂2003-0005。動物室溫度：（25±2）℃，相對濕度：（60±2）%。動物以廣西醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心配制的飼養(yǎng)。

1.2主要藥品和試劑 氟化鈉（北京化工廠生產(chǎn)，分析純，批號：20090703）。谷丙轉(zhuǎn)氨酶測定試劑盒（批號：20091114），谷草轉(zhuǎn)氨酶測定試劑盒（批號：20091114），總抗氧化能力測定試劑盒（批號：20090918），丙二醛測定試劑盒（批號：20090918），超氧化物歧化酶測定試劑盒（批號：20090905），谷胱甘肽測定試劑盒（批號：20090905），考馬斯亮蘭蛋白測定試劑盒（批號：20050723）測定，均為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品。

1.3主要儀器 電熱恒溫水?。ū本╅L安科學(xué)儀器廠）；低溫高速離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；722S分光光度計(jì)（南京建成生物工程研究所（北京長源實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠）；漩渦混合器XW-80A（上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠）；電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司天平儀器廠）。

1.4動物分組 健康Wistar大鼠60只，隨機(jī)分為四組，每組15只，分別分為空白對照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組電針治療組。其中低、中、高劑量組大鼠分別自由飲用有含氟化鈉55、110、222mg/L的煮沸冷卻自來水，空白對照組大鼠自由飲用煮沸冷卻自來水。給藥期間稱體重1次/2w，并觀察一般狀況，有無死亡等情況，實(shí)驗(yàn)周期共3個月。

1.5指標(biāo)觀察與測定 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后收集24h尿，以待測定尿氟，各組摘除大鼠眼球取血，靜置后3000r/min離心15min分離血清，采用采用氟離子選擇電極法測定尿氟、血氟含量；同時按試劑盒說明，采用賴氏法測定血清ALT和AST活性。頸椎脫臼處死大鼠，取肝臟左葉剪碎后加入9倍生理鹽水在冰浴中制成10%（W/V）肝勻漿組織液，3000r/min離心15min分離上清液，于-20℃保存待測。分別比色法測定肝組織中T-AOC活力、硫代巴比妥酸染色法測定MDA含量、黃嘌呤氧化酶法測定SOD活性和二硫代雙硝基苯甲酸法測定GSH含量，考馬斯亮藍(lán)法檢測肝臟組織蛋白，均采用南京建成生物工程研究所產(chǎn)品試劑盒，嚴(yán)格按照均按照說明書操作測定。

1.6數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 統(tǒng)計(jì)計(jì)量資料以（x±s）表示，采用單因素方差分析，所有數(shù)據(jù)均在計(jì)算機(jī)中由SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理。

2 結(jié)果

2.1一般狀況 空白對照組和低劑量組大鼠活動正常，體重增長正常，毛色光澤；而中、高劑量組大鼠安靜少動、體重體重增長率隨染毒劑量增加呈降低趨勢，飲水量偏多，部分大鼠毛色無光澤?？瞻讓φ战M大鼠門牙呈棕黃色，表面色澤光滑；中、高劑量組所有大鼠門齒均有白堊，表面粗糙，光澤偏黃色，重者甚至發(fā)生牙齒缺損。實(shí)驗(yàn)期間，正常對照組雌性大鼠死亡1只；中劑量組雄性大鼠死亡2只；高劑量組雄性大鼠死亡3只，雌性大鼠死亡1只。

2.2氟化鈉慢性中毒大鼠尿氟、血氟含量變化 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，3個月后氟化鈉各劑量組大鼠尿氟、血氟含量顯著高于正常對照組（P<0.01），表明氟化鈉慢性中毒模型建立成功。而且隨著染氟劑量增加，尿氟和血氟含量也增高，具有劑量-反應(yīng)關(guān)系，見表1。

2.3氟化鈉慢性中毒大鼠血清轉(zhuǎn)氨酶變化 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常對照組相比，氟化鈉中、高劑量組大鼠AST、ALT活性水平顯著升高（P<0.01），表明慢性中毒過程中氟化鈉誘發(fā)大鼠肝臟損傷，見表2。

2.4氟化鈉慢性中毒大鼠肝臟脂質(zhì)過氧化的改變 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，給予氟化鈉3個月后，氟化鈉各個劑量組大鼠肝臟中脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA具有顯著性增高（P<0.05、P<0.01），且與劑量的增加呈現(xiàn)一定的正比關(guān)系；而SOD和T-AOC隨著氟化鈉劑量的增加而顯著性降低（P<0.05、P<0.01），表明機(jī)體抗氧化能力作用減弱。同樣中、高劑量組GSH含量活性顯著下降（P<0.01，P<0.05），見表3。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用含不同劑量氟化鈉的煮沸冷卻自來水喂飼大鼠3個月后，氟化鈉各劑量組大鼠尿氟、血氟含量均顯著高于正常對照組（P<0.01），表明成功地復(fù)制氟化鈉慢性中毒大鼠模型。肝臟是機(jī)體的主要解毒器官，催化氨基轉(zhuǎn)移作用的轉(zhuǎn)氨酶在肝臟中含量豐富，當(dāng)肝臟有損傷時，酶可以由損傷的細(xì)胞釋放入血中，使血液中轉(zhuǎn)氨酶活性顯著增高。ALT、AST均為非特異性功能酶，正常時血清的含量很低，但當(dāng)肝受損時，肝通透性增加，胞漿內(nèi)的AST、ALT釋放入血漿，致使血清AST、ALT的酶活性升高[5]。酶活性的高低變化與肝細(xì)胞受損的程度相一致，所以常作為肝功能檢測的敏感指標(biāo)，此外，二者均可導(dǎo)致微粒體鈣泵活性降低，使胞質(zhì)Ca2+含量升高，細(xì)胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)遭到破壞，從而引起細(xì)胞代謝紊亂甚至死亡。目前國內(nèi)外有關(guān)氟與細(xì)胞凋亡的研究大多采用了流式細(xì)胞術(shù)方法，井鈴等[6]應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)發(fā)現(xiàn)加氟組大鼠肝臟凋亡百分率較對照組明顯升高，證明了氟可導(dǎo)致大鼠肝細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示氟化鈉中、高劑量組大鼠血清AST、ALT活性明顯升高（P<0.01），說明氟中毒誘導(dǎo)了大鼠肝細(xì)胞凋亡，提示氟化鈉慢性中毒能夠誘發(fā)大鼠肝損傷，并且損傷程度與氟化鈉劑量呈現(xiàn)一定的劑量關(guān)系。

目前，地氟病發(fā)病機(jī)理尚未能夠明確闡明，氧化應(yīng)激引起的自由基代謝紊亂損傷在地氟病中的一直是研究熱點(diǎn)。在正常情況下，體內(nèi)氧自由基的產(chǎn)生和清除是平衡的，當(dāng)氧自由基產(chǎn)生過多或抗氧化體系出現(xiàn)故障，體內(nèi)氧自由基代謝就會出現(xiàn)失衡，或稱氧化應(yīng)激[7，8]?；钚匝踝杂苫梢耘c機(jī)體內(nèi)多種生物分子發(fā)生反應(yīng)，破壞正常組織的結(jié)構(gòu)和功能，造成組織細(xì)胞生物膜、蛋白質(zhì)、核酸等損傷。如氧自由基能攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸，引發(fā)脂質(zhì)過氧化作用，最終生成產(chǎn)物為MDA。因此，MDA的測定常常與SOD相互配合，MDA的高低間接反應(yīng)了機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度，SOD活力的高低間接反應(yīng)了機(jī)體清除氧自由基的能力，保護(hù)細(xì)胞免受氧自由基損傷，通過SOD和MDA的結(jié)果分析就可以知道機(jī)體內(nèi)氧化應(yīng)激的情況。有研究報道自由基或其脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物易穿透核膜而直接損傷DNA，使凋控基因（P53、Bcl-2）等遭到破壞，干擾細(xì)胞生長和死亡的平衡，導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生凋亡[9]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示氟化鈉各個劑量組與正常對照組相比MDA含量明顯增高（P<0.01），而SOD活性顯著降低（P<0.01），同樣，T-AOC和GSH也均顯著性下降，表明機(jī)體吸收過量的氟后肝臟組織過氧化作用增強(qiáng)，使機(jī)體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，抗氧化能力下降，造成機(jī)體氧化與抗氧化防御機(jī)制之間的失衡，這與相關(guān)文獻(xiàn)報道相一致[1]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，機(jī)體攝入過量的氟后，體內(nèi)自由基代謝紊亂，造成機(jī)體內(nèi)過氧化作用增強(qiáng)和抗氧化能力降低，與肝損傷具有密切的相關(guān)性。同時也為證明氟中毒的自由基學(xué)說提供了有力的證據(jù)?？偠灾?，氟化鈉慢性中毒能夠引起肝臟損傷，氧化應(yīng)激引起的自由基化損傷作用很可能是氟化鈉致大鼠肝損傷的重要原因之一，本研究結(jié)果為預(yù)防和治療地氟病患者提供了科學(xué)依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1]郭曉英，孫貴范，孫憲民，等.氧化應(yīng)激在亞慢性氟中毒大鼠肝臟損傷中的作用[J].中國公共衛(wèi)生，2003，19（5）：575-576.

[2]郭曉英，陳愛莉，孫責(zé)范.氟對大鼠肝臟氧化應(yīng)激及超微結(jié)構(gòu)的影響[J].中國醫(yī)科大學(xué)學(xué)報.2005， 34（4）：321-322.

[3]陳楊，于燕妮，呂學(xué)霞，等.氧化應(yīng)激在燃煤污染型氟中毒大鼠中的作用[J].中國實(shí)用醫(yī)藥，2008，3（4）：1-3.

[4]Guan ZZ， Xiao KQ， Zeng XY， et al. Changed cellular membrane lipid composition and lipid peroxidation of kidney in rats with chronic fluorosis[J].Arch Toxiocl，2001，74（10）：602-608.

[5]時昭紅，劉浩，劉嵩.銀杏葉提取物抗大鼠肝纖維化中激活索A和肝細(xì)胞凋亡的作用[J].世界華人消化雜志，2006，14（21）：2060-2066.

[6]井玲，邵宗俊，任力群，等.氟中毒大鼠肝細(xì)胞凋亡研究[J].中國地方病學(xué)雜志，1999，18（2）：84-86.

[7]孫玉富.自由基與氧化應(yīng)激及其在地方性氟中毒發(fā)病中的作用.中國地方病防治雜志，2003，18（1）：37-40.

[8]劉戎，魏鳳輝，宣照林.自由基與氟中毒.中國地方病防治雜志，2003，18（6）：353-355.

[9]劉欣，劉先義.細(xì)胞凋亡與氧自由基[J].湖北民族學(xué)院學(xué)報.2002，19（4）：31-33.

編輯/哈濤