腸炎沙門(mén)氏菌SDA—瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)技術(shù)研究

尼秀媚　魏曉棠

摘要[目的] 建立腸炎沙門(mén)氏菌的SDA快速檢測(cè)方法。[方法] 根據(jù)腸炎沙門(mén)氏菌invA基因片段設(shè)計(jì)鏈置換擴(kuò)增（SDA）引物， 建立腸炎沙門(mén)氏菌的SDA快速檢測(cè)方法， 并對(duì)設(shè)計(jì)的引物的靈敏度和特異性進(jìn)行研究。[結(jié)果] 成功建立了腸炎沙門(mén)氏菌的SDA快速檢測(cè)方法，SDA反應(yīng)成功擴(kuò)增了目標(biāo)序列。建立的SDA檢測(cè)技術(shù)對(duì)腸炎沙門(mén)氏菌的檢測(cè)靈敏度達(dá)到7.0×103 cfu/ml，且特異性良好。[結(jié)論] 試驗(yàn)選取的序列和引物具有較高的特異性，可用于腸炎沙門(mén)氏菌的特異性檢測(cè)。

關(guān)鍵詞 腸炎沙門(mén)氏菌；鏈置換擴(kuò)增；瓊脂糖凝膠電泳

中圖分類(lèi)號(hào)S852.6文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2014）22-07443-02

人類(lèi)腸炎沙門(mén)氏菌發(fā)病率持續(xù)增高，已引起了人們的廣泛關(guān)注，并成為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和食品安全的重要研究課題之一[1]。沙門(mén)氏菌食物中毒約占細(xì)菌性食物中毒的42.6%～60%，世界貿(mào)易組織（WTO）已將沙門(mén)氏菌列為具有中等危害和嚴(yán)重危害的食物傳播性病原[2]，而經(jīng)蛋傳播是腸炎沙門(mén)氏菌感染癥的最重要傳播途徑之一。雞蛋是老百姓餐桌上必不可少的食物之一，因此對(duì)腸炎沙門(mén)氏菌的檢測(cè)就顯得尤為重要[3]。

目前，腸炎沙門(mén)氏菌的檢測(cè)方法有PCR技術(shù)、ELISA方法、LAMP方法等，各種方法既有優(yōu)點(diǎn)，也有缺點(diǎn)。鏈替代擴(kuò)增技術(shù)（SDA）最早是由Walker等于1992年開(kāi)發(fā)，這是一種基于酶促反應(yīng)的DNA 體外等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，主要利用限制性內(nèi)切酶剪切DNA 識(shí)別位點(diǎn)的能力和DNA 聚合酶在切口處向3延伸并置換下游序列的能力，在等溫條件下進(jìn)行擴(kuò)增。整個(gè)過(guò)程由準(zhǔn)備單鏈DNA 模板、生成兩端帶酶切位點(diǎn)的目的DNA 片段、SDA 循環(huán)擴(kuò)增3 個(gè)步驟組成[4]。SDA 技術(shù)的突出優(yōu)點(diǎn)是擴(kuò)增效率高，反應(yīng)時(shí)間短，目標(biāo)基因能在15 min 內(nèi)擴(kuò)增109～1010倍[5]。筆者采用SDA方法[6-7]用2對(duì)引物對(duì)腸炎沙門(mén)氏菌進(jìn)行檢測(cè)，建立腸炎沙門(mén)氏菌的SDA快速檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 菌株。試驗(yàn)所用的7株腸炎沙門(mén)氏菌及其近緣菌株購(gòu)自中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心（CGMCC），具體見(jiàn)表1；標(biāo)準(zhǔn)菌株分別購(gòu)自美國(guó)典型菌種保藏中心（ATCC）和中國(guó)醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心（CMCC）。

1.1.2培養(yǎng)基。LB培養(yǎng)基：10 g/L蛋白胨、5 g/L酵母提取物、10 g/L NaCl；LB固體培養(yǎng)基：在LB培養(yǎng)基中加入15 g瓊脂粉。