副溶血弧菌在玻璃器皿上的粘附及去除

高璐等

摘要[目的] 研究副溶血性弧菌在玻璃器皿上的粘附及去除技術(shù)。[方法] 以載玻片模擬廚房中的玻璃類和陶瓷類廚具，選用酒精、醋酸及乳酸鏈球菌素作為抑菌劑對人工污染粘附到載玻片上的副溶血性弧菌進行處理，通過觀察副溶血性弧菌在載玻片上的存活數(shù)和去除率考察3種抑菌劑及其協(xié)同抑菌作用。[結(jié)果] 載玻片上粘附的副溶血性弧菌的活菌數(shù)經(jīng)生理鹽水和不同濃度的酒精、醋酸和乳酸菌鏈球菌素作用后均有一定程度的降低，抑菌劑組殘留的活菌數(shù)（殘留率）明顯低于生理鹽水對照組，各抑菌組的抑菌能力均隨著抑菌劑濃度的增加而增強。協(xié)同抑菌試驗結(jié)果表明，pH 4.0、35%酒精、1.0 g/L乳酸鏈球菌素的組合能有效抑制副溶血性弧菌在玻片上的粘附，具有良好的協(xié)同效應。[結(jié)論]副溶血性弧菌在玻璃器皿上有一定的粘附力，但酒精、醋酸和乳酸菌鏈球菌素具有較好的除菌效果。

關(guān)鍵詞副溶血弧菌；粘附；除菌

中圖分類號S182；R187.2文獻標識碼A文章編號0517-6611（2014）36-13015-03

Abstract[Objective] To study the adhesion and degerming of Vibrio parahaemolyticus on glassware. [Method] The effects of three natural edible components including acetic acid， alcohol and Nisin on the survival rate of Vibrio parahaemolyticus on glassware were explored through single factor and orthogonal array experiments. [Result] It was found that bacterial population on glassware was reduced when Vibrio parahaemolyticus cells were treated with acetic acid， alcohol and Nisin， and the residual rate is lower than the normal saline control group obviously. The orthogonal array optimization showed that the combined treatment of acetic acid， alcohol and Nisin could result in a synergistic inhibitory effect on Vibrio parahaemolyticus. Vibrio parahaemolyticus could be effectively inhibited after treatment with acetic acid solution（pH 4.0） containing 35% alcohol and 1.0 g/L Nisin. [Conclusion] These results suggest that Vibrio parahaemolyticus can adhere to the glassware， and the combined use of acetic acid， alcohol and Nisin can offer a compound antibacterial agent for reducing the risk of Vibrio parahaemolyticus infection during seafood consumption.

Key wordsVibrio parahaemolyticus； Adhesion； Degerming

副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus，簡稱VP）是一種革蘭氏陰性嗜鹽性細菌，是我國特別是沿海城市引起食源性疾病的首要致病菌之一，這主要是由于沿海地區(qū)的居民有生食或半生食水產(chǎn)食品的習慣，也有調(diào)查顯示是由于廚房用具受到污染而引起[1]。我國華東沿海沿江地區(qū)副溶血性弧菌的檢出率高達57.4%～66.5%，夏秋季節(jié)更加嚴重[2]。因此，研究開發(fā)針對水產(chǎn)食品中及其廚具表面副溶血性弧菌的粘附能力及其天然抑菌劑等殺菌技術(shù)，減少污染，是控制其引起食物中毒的關(guān)鍵。資料顯示，酒精、醋酸及乳酸鏈球菌素（Nisin）對食源性致病菌如大腸桿菌O157∶H7 型（Escherichia coli O157∶H7）、單增李斯特菌（Listeria monocytogenes）、沙門氏菌（Salmonella）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）及腸道致病菌等均具有明顯抑菌效果[3-5]，但對水產(chǎn)品中尤其是廚房器具上污染的副溶血性弧菌的粘附與去除研究甚少見報道。筆者主要用載玻片模擬廚房中的玻璃和陶瓷類廚具，選用酒精、醋酸及乳酸鏈球菌素作為抑菌劑，研究副溶血性弧菌在玻璃器皿上的粘附和去除作用。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗用菌株。

致病性副溶血性弧菌菌株ATCC33847（tdh基因陽性）由揚州大學食品微生物實驗室保藏。

1.1.2培養(yǎng)基與試劑。

TCBS培養(yǎng)基為杭州微生物試劑有限公司產(chǎn)品；LBS培養(yǎng)基為細菌肉湯培養(yǎng)基（LB，杭州微生物試劑有限公司產(chǎn)品）添加2.5% NaCl配制；乳酸鏈球菌素（NISIN）為浙江銀象生物工程有限公司產(chǎn)品；其他化學試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3主要儀器。

UV7504C分光光度計，上海欣茂儀器有限公司；SX500型高壓蒸汽滅菌鍋，日本TOMMY公司；DGX9053B2型生化培養(yǎng)箱，上海福瑪實驗設備有限公司；ZHJHC1209B型超凈工作臺，上海智誠分析儀器制造有限公司；PHS3C精密酸度計，上海精密科學儀器有限公司；載玻片（25.4 mm×76.2 mm）。

1.2方法

1.2.1副溶血弧菌的復蘇及菌懸液的制備。

副溶血弧菌保種液0 ℃解凍，無菌吸取200 μl接種10 ml LBS液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)16 h；取培養(yǎng)物劃線于TCBS平板，37 ℃培養(yǎng)20 h，挑取單菌落接種5 ml LBS液體培養(yǎng)基，37 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)18 h后取出8 000 r/min離心10 min，棄去上清液，沉淀用滅菌PBS懸浮，調(diào)整菌液濃度約至108 CFU/ml，備用。

1.2.2抑菌劑的配制。

無菌操作配制體積分數(shù)為15%、20%、25%、30%、35%的酒精；pH為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0的冰醋酸；質(zhì)量體積濃度為0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 g/L的乳酸鏈球菌素作為抑菌劑，滅菌生理鹽水作為對照。

1.2.3副溶血弧菌的粘附與抑菌試驗。

將無菌載玻片浸沒到副溶血性弧菌的菌懸液中10 min后取出，瀝去表面多余液體后再分別浸入3組不同濃度的抑菌劑中，3～4 min后取出，瀝去表面多余液體，用蘸有無菌生理鹽水的棉簽，在載玻片2個表面反復擦拭5次，并隨之轉(zhuǎn)動棉簽，然后剪去手接觸部分，將棉簽放入裝有10 ml生理鹽水的試管中，充分振蕩后進行10倍稀釋，取3個不同的稀釋度各100 μl涂布TCBS平板，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16～18 h，計數(shù)。每個處理均做3個平行試驗，取平均值。

1.2.4協(xié)同抑菌試驗。

根據(jù)以上單因素試驗的結(jié)果，設計3因素4水平的協(xié)同抑菌試驗。選用L16（44）正交試驗設計表，因素水平設計如表1，用無菌生理鹽水配制4 種體積分數(shù)酒精，再滴加冰醋酸調(diào)節(jié)體系pH ，最后加入乳酸鏈球菌素溶解，保證體系中各物質(zhì)濃度、pH與設定的因素水平一致。各體系的抑菌方法同“1.2.3”。

2結(jié)果與分析

2.1抑菌劑對副溶血弧菌粘附量的影響

無菌載玻片在副溶血性弧菌菌懸液中浸泡10 min，讓副溶血性弧菌自然粘附于玻片上，再分別浸泡于不同濃度的抑菌劑中，取出計數(shù)玻片上殘留副溶血性弧菌的總活菌數(shù)，結(jié)果見表2。

由表2可以看出，載玻片上粘附的副溶血性弧菌的活菌數(shù)經(jīng)生理鹽水和不同濃度的酒精、醋酸抑菌、乳酸菌鏈球菌素作用后具有一定程度的降低，抑菌劑組殘留的活菌數(shù)（殘留率）明顯低于生理鹽水對照組，且各抑菌組的抑菌能力均隨著抑菌劑濃度的增加而增強。

生理鹽水對載玻片上粘附的副溶血性弧菌可以去除65%左右。25%的酒精對副溶血性弧菌去除率接近96%，

35%的酒精處理后副溶血性弧菌的殘留率僅約為1%。醋酸

對粘附于載玻片上的副溶血性弧菌也有較好的清除效果，當pH 3.5時玻片上的副溶血性弧菌殘留率僅為7.4%，當pH達3.0時的去除率更佳，殘留率僅為1.9%。而經(jīng)乳酸鏈球菌素處理后，也是隨其濃度的增加其去除效果更好，當乳酸鏈球菌素濃度達1.2 g/L時，其殘留率只有6.4%。這些數(shù)據(jù)顯示，這3種抑菌劑對副溶血性弧菌的粘附與生長均具有一定的抑制作用。

2.2抑菌劑協(xié)同后對副溶血弧菌粘附量的影響由表3極差R值可知，主要影響因素為酒精體積分數(shù)和酸度，其次為乳酸鏈球菌素質(zhì)量濃度。當3個因素的組合為A2B4C2、A3B4C3和A4B4C4時，能使玻片上殘留的副溶血性弧菌含量去除將近3個數(shù)量級，具有較好的效果。根據(jù)K值，其最優(yōu)組合為A4B4C4，但即使是最優(yōu)組合，也沒能全部去除玻片上殘留的副溶血性弧菌，這可能與試驗所選擇的作用時間較短（3～4 min）有一定的關(guān)系。且在實際廚房用具上的帶菌量沒有試驗中模擬的這么多，并考慮抑菌劑的用量，故選擇A2B4C2為最佳組合，即pH 4.0、35%酒精、1.0 g/L乳酸鏈球菌素的組合能有效抑制副溶血性弧菌在玻片上的粘附，且各抑菌成分濃度較低，有良好的協(xié)同效應。

對正交協(xié)同試驗結(jié)果進行方差分析，并對各因素進行顯著性檢驗，結(jié)果顯示，F(xiàn)A=33.47，F(xiàn)B=4191，F(xiàn)C=2100，3個因素均差異顯著。通過方差分析及方差齊性檢驗可知，酸度、酒精體積分數(shù)與乳酸鏈球菌素質(zhì)量濃度對副溶血性弧菌的抑菌效果均為極顯著（F0.05

3討論

酒精和醋酸分別是酒、食醋的主要成分，是天然的抑菌物質(zhì)。乳酸鏈球菌素（Nisin），又稱乳酸鏈球菌肽或乳鏈菌肽，是由乳酸鏈球菌經(jīng)特定發(fā)酵所產(chǎn)生的多肽類抗菌物質(zhì)，能有效地抑制容易引起食品腐敗變質(zhì)的大多數(shù)革蘭氏陽性菌和部分革蘭氏陰性致病菌。Nisin是一種純天然的安全生物防腐劑[6]。目前，我國已批準Nisin 作為一種純天然食品防腐劑廣泛用于乳制品、發(fā)酵飲品、罐藏食品、肉類及肉制品的防腐保鮮[7-9]。

所以該研究選用酒精、醋酸及乳酸鏈球菌素作為抑菌劑，以載玻片模擬廚房中的玻璃和陶瓷類廚具，研究副溶血性弧菌在玻璃器皿上的粘附和去除作用。試驗結(jié)果表明，酒精、醋酸和乳酸鏈球菌素均對副溶血性弧菌的粘附和生長具有明顯的抑制作用。

然而，單因素試驗結(jié)果表明，酒精、醋酸及乳酸鏈球菌素的抑制效果與其濃度密切相關(guān)。而日常食用時的濃度往往達不到高濃度，這會直接影響到抑菌效果，因此僅僅依靠其中一種很難達到較好的抑菌效果。同時，有研究指出酒的抑菌效果要優(yōu)于與其度數(shù)相同濃度的酒精，如將酒中揮發(fā)性物質(zhì)（主要為酒精）除去后剩下的難揮發(fā)性物質(zhì)（主要為有機酸類）仍有較好的抑菌效果[10]。Sheth等研究也表明，含有蘋果酸、酒石酸等有機酸的低度酒（pH 3.5，酒精體積分數(shù)10%）可以使得副溶血性弧菌含量下降3～6個數(shù)量級[11]。這也說明了將不同有抑菌活性的食用成分復合使用，可以增強抑菌效果。從該試驗結(jié)果可知，它們之間的協(xié)同抑菌效果是很明顯的，能在降低各組分實際濃度的同時保持較好的抑菌效果。

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