寧夏枸杞甜菜堿乙醛脫氫酶獿bBADH2的克隆與序列分析

樊云芳　陳曉軍　曹有龍

摘要以寧夏枸杞為試驗(yàn)材料，利用同源克隆技術(shù)，設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，克隆得到一個(gè)新的甜菜堿醛脫氫酶基因。該基因全長(zhǎng)cDNA為1 527個(gè)堿基，編碼508個(gè)氨基酸，編碼區(qū)兩側(cè)翼分別具有5′UTR （47 bp）和3′UTR （ 129 bp ）。在推導(dǎo)的氨基酸序列中，含有醛脫氫酶所具有的高度保守的十肽（VTlElGGKSP）以及與酶功能有關(guān)的半胱氨酸殘基（C）。進(jìn)化分析表明，它與番茄甜菜堿醛脫氫酶親緣關(guān)系最近，與其他藜科植物親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。該基因的獲得有助于理解枸杞這一鹽生植物耐鹽機(jī)理，為培育新的耐鹽枸杞奠定理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞寧夏枸杞；同源克?。籅ADH2

中圖分類號(hào)S567.1+9文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼

A文章編號(hào)0517-6611（2014）35-12798-05

Abstract A new gene of Betaine Aldehyde Dehydrogenase （BADH）， named LbBADH2， was obtained by RACE technology in Lycium barbarum. The full cDNA of LbBADH is consist of 1 527 base pairs and encode 508 aa.， 5′UTR （47 bp） and 3′UTR （129 bp ） locating both side of it. A high conserved decapeptide sequence ‘VTLELGGKSP and Cys， which are related to the activity of enzyme， are found in putative amino acid among all BADH. The evolutional analysis showed that LbBADH2 is closer with Solanum lycopersicum than others plant in genetic relationship. The obtaining of LbBADH2 will help understanding the mechanism of salt tolerance and lay theoretical foundation for developing new salttolerance variety in Lycium barbarum.

Key words Lycium barbarum； Homocloning； BADH2

枸杞（Lycium barbarum L.）屬于茄科枸杞屬落葉灌木，也是其中唯一一屬鹽生植物，其根系發(fā)達(dá)，具有抗旱、耐鹽堿、耐寒、耐瘠薄的特點(diǎn)，主要種植于輕度鹽漬化地區(qū)，是鹽漬化土地改良的先鋒植物。在當(dāng)前西部生態(tài)建設(shè)和中藥材基地建設(shè)中，枸杞具有很高的生態(tài)、經(jīng)濟(jì)和社會(huì)價(jià)值[1- 2]。

甘氨酸甜菜堿（簡(jiǎn)稱甜菜堿）是甘氨酸的衍生物，被認(rèn)為是最好的滲透調(diào)節(jié)劑。在植物體

內(nèi)，甜菜堿由膽堿經(jīng)兩步氧化生成，催化第2步反應(yīng)的是甜菜堿醛脫氫酶（betaine aldehyde dehydrogenase，BADH）[3]。目前BAHD已經(jīng)從鹽節(jié)木（Halocnemum strobilaceum）[4]、鹽穗木（Halostachys caspica）[5]、堿蓬（Suaeda liaotungensis）[6-7]、梭梭（Haloxylon ammodendron）[8]、菠菜（Spinacia oleracea）[9]、濱藜（Atriplex centralasiatica）[10]、山菠菜（Atriplex hortensis）[11]、甜菜（Beta vulgaris）[12]、鹽爪爪（Kalidium foliatum）[13]等藜科植物，小麥（Triticum aestivum）[14]、水稻（Oryza sativa）、短芒大麥草（Hordeum brevisubulatum）等禾本科植物以及油菜（Brassica napus）[15]等其他植物中分離克隆。在鹽生植物寧夏枸杞中雖然已經(jīng)克隆了BADH1[16]，但在枸杞復(fù)雜的耐鹽生理過程中是否存在除BAHD1外的甜菜堿醛脫氫酶尚未見報(bào)道。筆者以寧夏枸杞葉片為試驗(yàn)材料，利用同源克隆技術(shù)分離克隆到BADH2，從進(jìn)化角度分析其在耐鹽生理過程中的保守性。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1植物材料。

2013年5月，在寧夏枸杞種質(zhì)資源圃中，取寧杞1號(hào)幼嫩枸杞根、莖、葉片、花等植物材料，低溫冰盒保藏后帶回實(shí)驗(yàn)室，然后置于-70 ℃冰箱中備用，隨后提取總RNA。

1.1.2載體與試劑。

RNA提取試劑盒為SV Total RNA Isolation System（Promega）； RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒為mPromII Reverse Transcriptase（Promega）、離心柱型瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒為Wizard SV Gel and PCR Cleanup System（Promega）；T連接載體試劑盒為pGEMT easy II Vector（Promega），5′RACE和3′RACE試劑盒均為Takara公司產(chǎn)品，Taq DNA聚合酶與DNA分子量marker為Tiangen公司產(chǎn)品；引物由北京奧科公司合成；其余試劑均為分析純。

1.2方法

1.2.1總RNA的提取。按Promega 公司SV Total RNA Isolation System試劑盒操作指南進(jìn)行。

1.2.2總cDNA的反轉(zhuǎn)錄。

按Promega 公司mPromII Reverse Transcriptase試劑盒進(jìn)行。取2 μg枸杞葉片總RNA，以O(shè)ligo dT為引物，進(jìn)行總cDNA反轉(zhuǎn)錄。反應(yīng)體系為20 μl，MMlV RT buffer 4 μl，總RNA 2 μl，dNTP 2 μl，反轉(zhuǎn)錄酶MMlV 1 μl，Oligo （dT）16 1 μl，RNA酶抑制劑RNasesin 0.5 μl，加DEPC處理的H2O 至20 μl。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)為42 ℃ 60 min，95 ℃ 5 min，3 ℃ 3 min。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物置于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3BADH基因核心序列的PCR擴(kuò)增 。

根據(jù)GenBank上已發(fā)表的BADH基因序列（GenBank登錄號(hào)分別為FJ228482、BT013588、FJ514799、DQ497233、DQ923617）設(shè)計(jì)一對(duì)簡(jiǎn)并引物，從枸杞葉片cDNA擴(kuò)增該基因的核心片段。上游引物為P1（CGNCARYVTTTCATYGAYGG），下游引物為P2（TTCYCCDAGYTCDCGBCCAAA NCCRCTRCG），預(yù)期擴(kuò)增片段大小為1 392 bp。PCR反應(yīng)體系為25 μl，包含10×buffer 2.5 μl，dNTP（2.5 mmol/μl）1.5 μl，上、下游引物（10 μmol/μl）各1 μl，Taq聚合酶（5 U/μl）1 μl，總cDNA（1 μg/μl）1 μl，加ddH2O至25 μl。反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃ 變性30 s、50 ℃退火40 s、72 ℃延伸50 s，30個(gè)循環(huán)后，72 ℃延伸10 min。

1.2.4BADH基因3′RACE擴(kuò)增。

根據(jù)其他已發(fā)表物種的BADH2基因cDNA序列設(shè)計(jì)BADH2基因的3′ RACE的引物P3（CTGAAGAGG AAGCCATTGAG）和P4（TTCTCAGTCAGGGTGTGTC），按照Takara 3′Full RACECore Set Ver.2.0說明書進(jìn)行3′ RACE擴(kuò)增，預(yù)期擴(kuò)增片段大小為362 bp。

1.2.5BADH基因5′RACE擴(kuò)增。

根據(jù)其他已發(fā)表物種的BADH2基因cDNA序列設(shè)計(jì)5′RACE引物P5（TCAGGATGTGAAACCAAAGGAGAACCAG）和P6（GAGGTAATAGATGCCATTTCAGACGGCT），按照Takara 5′Full RACE Kit 說明書進(jìn)行5′ RACE 擴(kuò)增，預(yù)期擴(kuò)增片段大小為628 bp。

1.3克隆與測(cè)序

1.3.1BADH2基因完整序列的測(cè)序與拼接。所有基因片段送北京天根生物公司測(cè)序。將核心序列、3′ RACE測(cè)序結(jié)果與5′ RACE 測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接，所得即為BADH2基因cDNA 的完整序列。

1.3.2BADH2基因cDNA 完整ORF的PCR擴(kuò)增。

根據(jù)測(cè)序結(jié)果，設(shè)計(jì)BADH2基因完整ORF序列的上游引物P7（GAAAAACTCATATCAGTAGCATTTAGC）和下游引物P8（GCTCTTAAAGATGAAATAAACAGAAGAGG），以枸杞葉片反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，測(cè)序確認(rèn)，預(yù)期擴(kuò)增片段大小為1 527 bp。

1.4BADH2基因的進(jìn)化分析

采用www.ncbi.nlm.nih.gov中的BlAST軟件、DNAMAN7.0，對(duì)編碼BADH2蛋白基因序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析；采用MEGA 5.05軟件繪制進(jìn)化樹，計(jì)算方法采用Neighborjoining方法，Bootstrap 設(shè)置為1 000[9]。

安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)2014年

2結(jié)果與分析

2.1LbBADH2 cDNA序列的獲得

以枸杞葉片cDNA為模板，設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物擴(kuò)增LbBADH2保守核心序列，擴(kuò)增片段大小為1 392 bp（圖1），與預(yù)期大小一致，測(cè)序獲得LbBADH2保守核心序列；3′ RACE擴(kuò)增片段大小為362 bp（圖2），與設(shè)計(jì)一致，測(cè)序后獲得LbBADH2 3′序列；5′ RACE結(jié)果擴(kuò)增片段大小為628 bp（圖4），與設(shè)計(jì)一致，測(cè)序后獲得LbBADH2 5′序列；將 LbBADH2保守核心片段、3′片段、5′片段序用DNAMAN（V7.0）生物軟件進(jìn)行拼接，重新設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增該基因全長(zhǎng)序列，擴(kuò)增大小

3討論

在植物中BADH基因是以小的多基因家族的形式存在。在甜菜BADH基因的研究中，發(fā)現(xiàn)在單倍體基因組中至少有2個(gè)相關(guān)序列[19]。在水稻中也發(fā)現(xiàn)有大量乙醛酸脫氫酶（AlDH） 基因家族[20]，大麥中含有一個(gè)2～3個(gè)成員小的多基因家族[21]；胡楊[22]、甘菊[23]、三角葉濱藜[24]均克隆到該基因的2個(gè)成員。 這種多個(gè)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物有可能是一個(gè)轉(zhuǎn)錄本不同剪切方式造成，甘菊2個(gè)基因可能是由于此方式造成。但從枸杞2個(gè)基因比對(duì)和進(jìn)化分析看出，推測(cè)它們是由不同基因所編碼。這2個(gè)基因在應(yīng)答鹽脅迫時(shí)，不同的響應(yīng)方式及表達(dá)模式還需進(jìn)一步研究。

在已報(bào)道的BADH氨基酸序列中，存在2種有關(guān)該酶蛋白定位的信號(hào)肽。一種是N 端信號(hào)肽，其氨基酸序列為QlF IDGE，被認(rèn)為是定位于葉綠體的信號(hào)，但該信號(hào)肽缺乏典型性；另一種是C 端信號(hào)肽，氨基酸序列為SKl，是定位于過氧化物酶體中的信號(hào)。從目前研究結(jié)果看，將具有C 端信號(hào)肽SKl的BADH定位于過氧化物酶體已無爭(zhēng)議，但對(duì)具有不典型N 端信號(hào)肽的BADH定位問題尚有爭(zhēng)論。在LbBADH2推導(dǎo)的氨基酸序列中，含有醛脫氫酶所具有的高度保守的十肽（VTlElGGKSP）以及與酶功能有關(guān)的半胱氨酸殘基（C）。這些殘基可能包含NAD+結(jié)合位點(diǎn)和酶催化位點(diǎn)[17]。 在5′端含有不典型的信號(hào)肽QlFIDGE，表明該酶可能定位于葉綠體中[18]

提高農(nóng)作物（大豆[25]、玉米[26]）、牧草（苜蓿[27]）耐鹽性的BADH基因轉(zhuǎn)化已有報(bào)道，該研究所克隆的寧夏枸杞BADH2基因?yàn)槟望}植物定向培育提供了選擇空間。

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