良渚北城墻考古土遺址表面藻類的分析研究

武發(fā)思 汪萬福 賀東鵬 徐瑞紅 蘇伯民

內(nèi)容摘要：為了探明造成潮濕環(huán)境土遺址生物污損的主要藻類類群，給后期生物退化機理的研究和防治體系的構(gòu)建提供可靠依據(jù)，本研究采用現(xiàn)代分子生物學技術(shù)，對杭州良渚北城墻考古土遺址表面的藻類進行了檢測和分析。結(jié)果表明，引起土遺址生物污損的病害藻類共3門5屬，主要為藍藻門念珠藻屬類群，硅藻門菱形藻屬與褐指藻屬類群次之，藍藻門殼藻屬與綠藻門的未鑒定屬最少。另外，苔蘚植物門蘚綱與薄囊蘚屬相近的類群在部分樣品中占絕對優(yōu)勢。光合藻類與苔蘚類群組成的不同主要受各采樣位點的空間位置和土體含水量的差異所影響。降低考古土遺址附存環(huán)境中的光照和滲水可以有效地控制有害光合生物體的滋生蔓延和侵蝕。

關鍵詞：土遺址；藻類；苔蘚；克隆文庫；群落組成；潮濕環(huán)境

中圖分類號：K854.39 文獻標識碼：A 文章編號：1000-4106（2014）04-0114-07

一 引 言

藻類是引起文物病害的常見生物類型，它們對文物的生物退化作用主要表現(xiàn)在美學價值的降低和材料性質(zhì)的改變兩個方面。研究發(fā)現(xiàn)，藍藻和綠藻在石質(zhì)文物的生物退化過程中扮演著先鋒入侵者的角色[1]。藻類細胞增殖及色素積累引起的覆蓋通常稱為生物污損，而因細胞生物活性作用導致材料分解的過程可稱為生物風化[2]。綠藻生物膜的形成促進了材料表面對空氣中污染物的捕獲能力，導致文物逐漸變黑[3，4]。同時，藻類可分泌大量的胞外聚合物，這種生物質(zhì)膠體在文化遺產(chǎn)材料孔隙內(nèi)的收縮與膨脹循環(huán)產(chǎn)生的機械力會進一步造成材質(zhì)結(jié)構(gòu)的破壞[5]。不僅如此，文物表面的沉積物和藻類固定的碳水化合物還可為其他異養(yǎng)微生物提供生長基質(zhì)，加速材料的退化[6]。石質(zhì)文物表面深綠色和黑褐色的硬殼狀沉積物主要由藍藻、綠藻、其他微藻、真菌和地衣組成[7，8]。藻類的生長和增殖在很大程度上受制于溫度、濕度、光照等環(huán)境因子，潮濕環(huán)境下建筑材料的變綠程度與其表面溫度的變化呈負相關，另外，濕度水平和營養(yǎng)供應對于藻類的生長和增殖也發(fā)揮著重要作用[9]。

我國文物資源豐富，歷史建筑與考古遺址在中原、南方等地區(qū)的潮濕環(huán)境中分布廣泛。受土體的物質(zhì)組成、結(jié)構(gòu)構(gòu)造及其他物理化學性質(zhì)的影響，土遺址本身就比較脆弱，在潮濕環(huán)境下更難以保存。近年來，我國文物保護工作者在潮濕環(huán)境土遺址原位加固材料的篩選[10]、“潮濕環(huán)境”范圍的界定[11，12]、保護理念的探索與技術(shù)的研發(fā)方面開展了大量卓有成效的工作[13]，為南方地區(qū)大型土遺址的保護提供了重要的理論依據(jù)和技術(shù)支持。

潮濕環(huán)境下土遺址病害生物的檢測和鑒定至關重要，直接影響到對后期腐蝕退化過程的研究和防治措施的建立。然而，我國在遺產(chǎn)地生物病害的研究領域開展的工作還較少，對于文物病害霉菌、藻類與苔蘚的鑒定主要依賴于傳統(tǒng)形態(tài)學等手段[14]，現(xiàn)代分子生物學檢測技術(shù)仍未能在病害生物類型的檢測中得到廣泛應用[15]。本研究以良渚古城北城墻考古土遺址表面的病害藻類為研究對象，旨在建立一種基于分子生物學技術(shù)的病害藻類快速檢測方法，為準確判定文化遺產(chǎn)地的病害藻類的群落組成提供技術(shù)支撐。

二 材料與方法

2.1 取樣地簡介

良渚遺址位于浙江省杭州市余杭區(qū)，年降水量在1150—1550mm之間。根據(jù)潮濕狀態(tài)下的土遺址分類及定量化的參數(shù)指標，該遺址地屬于典型的濕潤區(qū)潮濕環(huán)境與潮濕狀態(tài)下的土遺址[11]。

本文中的研究樣點為良渚古城遺址北墻TG2，即北墻中段保存較好的地段，有4m×30m的南北向考古發(fā)掘探溝1條，發(fā)掘面積120m2（圖1-a）。探溝東壁的地層堆積可分為耕土層、近代層、灰褐色斑塊土和黃褐色粉沙土等12層[16]?，F(xiàn)場調(diào)查發(fā)現(xiàn)，遺址主要存在著水的侵蝕、裂隙、根部掏蝕、生物污損等病害，保存難度很大，目前已經(jīng)采用搭建防雨棚等措施對土遺址進行了初步的保護。

2.2 樣品采集

在“文物出土現(xiàn)場保護移動實驗室”基礎平臺的支持下，項目組于2012年7月首先開展了研究樣點的生物病害的現(xiàn)狀調(diào)查，發(fā)現(xiàn)藻類、苔蘚等光合生物已造成土遺址的大面積污染，考古文化層難以分辨。根據(jù)病害生物對考古土遺址造成污損顏色的差異選擇3個采樣位點（圖1-b），其中L1位點大致位于探溝底部深褐色土層，病害生物呈深銅綠色的不規(guī)則圓形或斑塊狀分布；L2位點污染面積最大，呈淺黃綠色粉末狀，覆蓋了多個考古文化層；L3位點大致位于黃褐色土層，主要表現(xiàn)為綠色污染。在各位點隨機選擇了3個取樣點，采用無菌解剖刀收集病害生物體，分別置于無菌Eppendorf管中，帶回實驗室后用于樣品基因組總DNA的提取。

2.3 實驗方法

2.3.1 基因組總DNA提取

使用PowerSoilTM（MOBIO Laboratories，Solanabeach，CA，USA）DNA提取試劑盒提取樣品總DNA，分裝后置于-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3.2 目標片段擴增

分別以樣品總DNA為擴增模板，選擇CYA106F和CYA781R引物，擴增藍藻16SrDNA基因[17]；選擇p23SrV_f1和p23SnewR引物，擴增藻類23SrDNA 質(zhì)體序列[18]。反應體系（25μl）包括1U的Taq聚合酶，終濃度為0.2mM的dNTP，2.5μl10×反應緩沖液，單條引物濃度0.2mM，2.0μl模板（約含10ng DNA）。CYA106F和CYA781R引物對的擴增程序為：預變性94℃5min，然后在94℃變性45s，60℃退火45s，72℃延伸2min，完成35個擴增循環(huán)，終延伸72℃10min。p23SrV_f1和p23SnewR引物對的擴增程序為：預變性94℃2min，然后在94℃變性20s，55℃退火30s，72℃延伸30s，完成35個擴增循環(huán)，終延伸72℃10min。所有擴增產(chǎn)物用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增片段的大小與擴增特異性。

2.3.3 克隆文庫構(gòu)建與測序

擴增產(chǎn)物使用瓊脂糖DNA純化試劑盒進行純化。取純化后產(chǎn)物3μl，與pGEM-T載體（Promega）連接，并克隆至E.coli DH-5α受體菌制備的感受態(tài)細胞中。根據(jù)藍白斑篩選固體培養(yǎng)平板（LB中AMP濃度為100μg/ml，X-Gal為60μg/ml，IPTG為20μg/ml），每一轉(zhuǎn)化平板挑取約50—100個白斑，用T7/SP6引物對直接擴增驗證插入片段大小。

2.3.4 序列比對及系統(tǒng)發(fā)生關系分析

將確定無誤后的陽性克隆斑挑至液體LB試管中（含Amp 12μg/ml）37℃過夜培養(yǎng)，吸取1ml菌液送交測序公司完成序列測定（Shanghai Majorbio Bio-technology Co.， Ltd.）。所獲序列使用MEGA5.2軟件進行編輯[19]，并在NCBI基因數(shù)據(jù)庫中利用BLAST程序GenBank完成比對和相似序列的篩選，使用鄰接法（Neibor-Joining， NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹，靴值分析重復1000次。

三 實驗結(jié)果

3.1 克隆文庫序列

克隆文庫測序后，CYA106F和CYA781R引物對共得到序列115條（序列號：KF358576-

KF358690），利用BLAST程序比對后發(fā)現(xiàn)，克隆文庫中包含藍藻序列20條，其他藻類序列12條，非藻類序列83條，其中細菌序列4條，苔蘚植物葉

3.2 系統(tǒng)發(fā)生關系分析

在NCBI中利用BLAST程序比對所得序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的相似序列，選擇覆蓋度及相似度最高的1—2條作為參考序列，構(gòu)建CYA106F和CYA781R引物對的擴增產(chǎn)物16SrDNA及其相似序列系統(tǒng)發(fā)生樹（圖2）與引物p23SrV_f1和p23SnewR擴增產(chǎn)物23SrDNA及其相似序列系統(tǒng)發(fā)生樹（圖3）。

3.3 病害生物群落組成

通過序列比對，確定L1位點樣品經(jīng)CYA106F和CYA781R引物對擴增所得藻類序列主要隸屬于念珠藻屬（Nostoc），并占絕對優(yōu)勢；經(jīng)p23SrV_f1和p23SnewR引物對擴增藻類序列主要隸屬于藍藻門（Cyanophyta）念珠藻屬，為優(yōu)勢類群。L2位點樣品經(jīng)CYA106F和CYA781R引物擴增所得序列全部為非藻類序列，序列比對后發(fā)現(xiàn)其主要與苔蘚植物門（Bryophyta）蘚綱（Hepatopsida）薄囊蘚屬（Leptobryum）類群相近；p23SrV_f1和p23SnewR引物對未得到L2位點樣品擴增產(chǎn)物。L3位點樣品經(jīng)CYA106F和CYA781R引物擴增所得序列所屬門類較多，其中苔蘚植物門薄囊蘚屬為優(yōu)勢類群，硅藻門（Bacillariophyta）菱形藻屬（Nitzschia）與褐指藻屬（Phaeodactylum）次之，藍藻門殼藻屬（Microcoleus）及未鑒定細菌類群最少；p23SrV_f1和p23SnewR引物擴增產(chǎn)物序列主要為蘚綱薄囊蘚屬，其次為硅藻門菱形藻屬，藍藻門殼藻屬、念珠藻屬及綠藻門（Chlorophyta）未鑒定屬所占比例最少。

四 討 論

4.1 引物的特異性

本研究以良渚北城墻考古土遺址表面造成考古文化層覆蓋嚴重的綠色病害生物體為檢測對象，通過藍藻特異性引物和藻類通用引物[17， 18]，重點研究造成土遺址病害的藻類組成。本研究所選的兩個引物對在一定程度上均能實現(xiàn)潮濕環(huán)境中藻類病害的快速檢測和初步的種屬鑒定。但是，這兩對引物的擴增產(chǎn)物中包含大量的非藻類序列，如L2及L3位點樣品中的苔蘚序列，這種非特異性擴增不利于對樣品中藻類群落結(jié)構(gòu)的整體水平的研究，但并不影響對遺產(chǎn)地病害藻類的初步鑒定。苔蘚植物門葉綠體中16SrRNA也具有CYA106F和CYA781R的靶向擴增位點，主要可能是因為藻類與陸生植物葉綠體的16SrRNA序列具有較高的同源性[20]。然而該引物還無法解決苔蘚植物科、屬、種之間進化的問題，在今后的研究中有必要引入葉綠體基因23SrRNA、rbcL、trnL、trnF以及細胞核基因ITS、18S和26SrRNA等，開展各種苔蘚植物間及內(nèi)部系統(tǒng)發(fā)育關系的研究[21]。

4.2 主要病害類群

比對克隆文庫所獲序列后發(fā)現(xiàn)：L1位點主要受到了藍藻門念珠藻屬的污損；L2位點主要為苔蘚植物門蘚綱植物覆蓋；L3位點的生物呈現(xiàn)出多樣性，藍藻、其他藻類、苔蘚等均有出現(xiàn)。念珠藻為原核生物，沒有以核膜為界限的細胞核，藻體為多細胞的絲狀體，單一或多數(shù)藻絲在公共的膠質(zhì)被中。多數(shù)念珠藻可作食用，如發(fā)菜、葛仙米、螺旋藻等，有一些種類是引起水體水華的主要種類，具有重要的生態(tài)意義。念珠藻陸生種主要生長在潮濕土表、巖山上，或混雜于蘚類植物的莖葉間，有的可在表土下生活，它們也是造成考古遺址污損的主要類群。在印度阿旃陀石窟的濕壁畫上、Bishnupur寺廟的陶器上以及其他考古遺址的表面，研究者發(fā)現(xiàn)造成遺址結(jié)痂的藻類主要有16種，分屬于黏桿藻屬（Gloeothece）、黏囊藻屬（Myxosarcina）、念珠藻屬（Nostoc）、眉藻屬（Calothrix）等8個屬[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，在潮濕環(huán)境或潮濕狀態(tài)下，良渚考古土遺址所處的自然環(huán)境條件與土體表面微生態(tài)環(huán)境都非常適宜念珠藻的生長，也很容易造成土遺址的生物污損。苔蘚植物也多生長于陰濕的環(huán)境里，常見于石面、泥土表面、樹干或枝條上。最新調(diào)查發(fā)現(xiàn)，位于印度錫布薩格爾市的阿洪王國考古遺址面臨著嚴重的苔蘚植物的入侵問題，7種主要苔蘚對遺址的覆蓋率達15%[23]。我國學者通過對潮濕環(huán)境下的土遺址病害的分類研究發(fā)現(xiàn)，杭州良渚遺址和南京大報恩寺遺址均存在苔蘚病害，不僅影響土遺址的原貌，而且還形成結(jié)皮層，增大遺址土的滲透性和儲水性，非常不利于土遺址的保存與保護[11]。本研究中各位點群落的組成差異主要是由其所處位置土體內(nèi)的水分含量所決定的。L1位點位于考古發(fā)掘探溝底部，受滲水影響，土體含水量最高，接近飽和；L3位點位于底部和發(fā)掘剖面的交匯地帶，土體潮濕；而L2位點在考古發(fā)掘的豎直剖面上，位置稍高，土體含水量最低。眾所周知，在植物界的演化進程中，苔蘚植物本身代表著從水生逐漸過渡到陸生的類型。本研究進一步確定了造成良渚土遺址中植物損害的主要苔蘚類群，同時發(fā)現(xiàn)原核藻類藍藻、小型真核藻類硅藻和綠藻均也是造成土遺址污損的重要因素。

4.3 防治措施

對于遺址地病害生物的防治措施是文物保護工作者最關心的問題?；瘜W殺滅作為一種便捷的手段，一直被大量采用，但這種措施所具有的環(huán)境高毒性、失效快、易篩選產(chǎn)生抗性菌株等不足仍然無法克服。法國拉斯科洞穴的史前壁畫曾因安裝人工連續(xù)照明系統(tǒng)而導致大量綠藻的入侵，并被迫于1963年停止對公眾開放。洞穴管理方先后采用鏈霉素、青霉素、甲醛、生石灰、苯扎氯銨等來應對不斷變化的微生物病害問題，然而最新研究表明，被廣泛使用的季銨鹽類生物殺滅劑苯扎氯銨（Benzalkonium Chloride，BC，又稱潔爾滅）不僅對青枯菌（Ralstonia spp.）和假單胞菌（Pseudomonas spp.）無效，反而可被黑酵母（Black yeast）作為碳源代謝利用，加劇壁畫微生物病害的程度[24]。相比而言，一些新型的物理殺滅措施以其低成本、生態(tài)環(huán)境友好等優(yōu)勢而逐漸發(fā)展起來。如最近有研究稱，使用60℃熱休克處理法可殺滅所有的供試驗苔蘚植物，經(jīng)熱休克預處理后，便可用低于當前有效殺滅劑10倍濃度的化學殺滅劑完全殺滅[25]。針對潮濕環(huán)境下的土遺址，有研究指出，導致潮濕環(huán)境下土遺址破壞的主要誘因依次是大氣降水沖刷、地下水位波動和空氣濕度變化[12]，控制水環(huán)境的是解決潮濕環(huán)境土遺址保護的關鍵因素和先決條件[13]。另外，基于藻類與苔蘚植物的光合自養(yǎng)特性，控制遺產(chǎn)地的光照也可以起到事半功倍的效果。潮濕環(huán)境土遺址表面的藻類、地衣、苔蘚等病害生物的防治必須結(jié)合物理殺滅與清除、化學殺滅以及環(huán)境因子的控制等措施，以構(gòu)建綜合防治體系。

五 結(jié) 論

基于CYA106F/CYA781R和p23SrV_f1/p23

SnewR引物對的分子生物學技術(shù)可滿足遺產(chǎn)地多數(shù)病害藻類的檢測及優(yōu)勢類群的快速鑒定。

良渚北城墻考古遺址表面的病害生物主要為藍藻門念珠藻屬類群和苔蘚植物門薄囊蘚屬類群，硅藻門菱形藻屬與褐指藻屬類群次之，藍藻門殼藻屬與綠藻門未鑒定屬所占比例最低。

各采樣位點的空間位置與土體含水量的差異成為光合藻類與苔蘚類群組成的決定因素。

致謝：浙江省文物考古研究所和良渚管委會人員在采樣過程給予了大力幫助，在此深表謝意！

參考文獻：

[1]Crispim C A，Gaylarde C C.Cyanobacteria and biodeterioration of cultural heritage： a review[J].Microbial Ecology， 2005， 49（1）： 1-9.

[2]CutlerN， VilesH.Eukaryoticmicroorganisms and stone biodeterioration[J]. Geomicrobiology Journal， 2010， 27（6/7）： 630-646.

[3]Viles H A， Gorbushina A A. Soiling and microbial colonisation on urban roadside limestone： a three year study in Oxford， England[J]. Building and Environment， 2003， 38（9-10）： 1217-1224.

[4]Crispim C A.，Gaylarde C C. Gaylarde P.M.Biofilms on church walls in Porto Alegre， RS， Brazil，with

special attentionto cyanobacteria[J]. Interna-

tional Biodeterioration & Biodegradation，2004，54（2-3）： 121-124.

[5]Dornieden T H，Gorbushina A A，Krumbein W E.Patina-physical and chemical interactions of sub-aerial biofilms with objects of art. In： Ciferrio，Tiano P，Mastromei G.（Eds.）of Microbes and Art：The role of microbial communities in the degradation and protection of cultural heritage [M]， Kluwer Academic， Dordrecht，2000：105-119.

[6]Saiz-Jimenez C. Biodeterioration vs biodegrad-

ation：the role of microorganisms in the removal of pollutants deposited on historic buildings[J]. International Biodeterioration & Biodegrad-

ation，1997， 40（2-4）： 225-32.

[7]Ortega-Calvo J J， Sanchez-Castillo P M.， Hernandez-

Marine M.，etal.Isolation and characterizat-

ion of epilithic Chlorophytes and Cyanobacteria from two Spanish cathedrals（Salamanca and Toledo）[J]. Nova Hedwigia. 1993， 57（1-2）： 239-253.

[8]Macedo M F， Miller A Z， Dionísio A. et al. Biodiversity of cyanobacteria and green algae on monuments in the Mediterranean Basin： an overview[J].Microbiology， 2009， 155（11）： 3476-3490.

[9]Cutler N A， Viles H A， Ahmad S.Algal ‘greening and the conservation of stone heritage structures[J].Science of the Total Environment， 2013， 442： 152-164.

[10]周環(huán)，張秉堅，陳港泉，等. 潮濕環(huán)境下古代土遺址的原位保護加固研究[J].巖土力學，2008，29（4）：954-962.

[11]張虎元，李敏，王旭東，等. 潮濕土遺址界定及病害分類研究[J].敦煌研究，2011（6）：70-75.

[12]張秉堅，周環(huán)，王旭東.潮濕環(huán)境的定量判別初探：以杭州良渚遺址為例[J].敦煌研究，2010（6）：104-108.

[13]王旭東.潮濕環(huán)境土遺址保護理念探索與保護技術(shù)展望[J].敦煌研究，2013（1）：1-6.

[14]汪娟麗，李玉虎，肖亞萍. 南唐二陵墓室彩畫上滋生藻類、苔蘚與霉菌的種類鑒定[J].文物保護與考古科學，2012，24（3）：72-76.

[15]于淼，朱旭東，潘皎.石質(zhì)文物微生物檢測技術(shù)的研究進展[J].微生物學報，2011，51（11）：1447-1453.

[16]劉斌.杭州市余杭區(qū)良渚古城遺址2006—2007年的發(fā)掘[J].考古，2008（7）：3-10.

[17]Saunders G W， Moore T E. Refinements for the amplification and sequencing of red algal DNA barcode and RedToL phylogenetic markers： a summary of current primers， profiles and strategies [J]. Algae， 2013， 28（1）： 31-43.

[18]Nübel U，Garcia-Pichel F，Muyzer G.PCR primers to amplify 16S rRNA genes from cyanobacteria [J].Applied and Environmental Microbiology， 1997，63（8）： 3327-3332.

[19]Tamura K， Peterson D， Peterson N， et al. MEGA 5： Molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood， evolutionary distance， and maximum parsimony methods[J]. Molecular Biology and Evolution， 2011， 28（10）： 2731-2739.

[20]潘衛(wèi)東，張娟，張貴星，等. 藻類及陸生高等植物葉綠體16S rRNA 基因進化譜系及同源性分析[J].鄭州大學學報（醫(yī)學版），2004，39（1）：15-20.

[21]李晶，沙偉.苔蘚植物分子系統(tǒng)學研究概況[J].植物學通報，2004， 21（2）：172-179.

[22]Pattanaik B，Adhikary S P.Blue-green algal flora at some archaeological sites and monuments of India[J].Feddes Repertorium， 2002，113（3-4）：289-300.

[23]Verma P K，Kumar V，Kaushik P K，et al.Bryophyte invasion on famous archaeological site of Ahom dynasty ‘Talatal Ghar of Sibsagar，Assam（India）[J].Proceedings of the National Academy of Sciences， India Section B： Biological Sciences，2014，84（1）：71-74.

[24]Martin-Sanchez P M， Nováková A， Bastian F， et al.Use of biocides for the control of fungal outbreaks in subterranean environments：the case of the Lascaux Cave in France[J]. Environmental Science & Technology， 2012， 46（7）：3762-3770.

[25]Bertuzzi S，Carniel F C， Pipan G，et al. Devitaliz-

ation of poikilohydric lithobionts of open-air monuments by heat shock treatments： A new cases-

tudycentred on bryophytes[J].International Biodeterioration & Biodegradation， 2013， 84： 44-53.