固相微萃取與氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用測(cè)定肉產(chǎn)品中的克倫特羅

江勇 胡貴祥 朱惠芳

摘 要：建立了固相微萃取與氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用測(cè)定肉中克倫特羅的方法。在一定線性范圍內(nèi)，本方法相關(guān)系數(shù)0.9993，回收率96%～104%，檢出限0.48 μg /kg，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差7.1%。方法快速、準(zhǔn)確，具有良好的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

關(guān)鍵詞：固相微萃??；氣質(zhì)聯(lián)用；克倫特羅；肉

Using gas chromatography –mass spectra coupled with solid phase microextraction to

determine clenbuterol in meat

JIANG Yong1， HU Gui-xiang2， ZHU Hui-fang2

（1.School of Life Science， Jiangxi Science and Technology Normal University， Nanchang 330013， China；

2. Nanchang Center for Disease Control and Prevention， Nanchang 330038， China）

Abstract： A method was developed for determination of clenbuterol in meat with gas chromatography –mass spectra coupled with solid phase microextraction. The correlation coefficient was 0.9993， and the recovery were between 96%～104% with relative standard deviations of 7.1%. The detection limits was 0.48 μg /kg. The analytical procedure required simple operation and provided accurate and reliable results. The method could be applied in real works.

Keywords： solid phase microextraction； gas chromatography –mass spectra； clenbuterol； meat

中圖分類號(hào)：TS251.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

克倫特羅（Clenbuterol），俗稱“瘦肉精”[1-2]，具有松弛支氣管平滑肌的作用，常用于治療哮喘，為強(qiáng)效選擇性β2-受體激動(dòng)劑?？藗愄亓_能夠改變動(dòng)物體內(nèi)的脂肪分布，增加瘦肉率，90年代以來，克倫特羅廣泛應(yīng)用于飼料添加劑中，引起了大量“瘦肉精”食物中毒事件。如今克倫特羅已被世界上大多數(shù)國家在畜牧養(yǎng)殖中禁止使用[3-5]。

檢測(cè)肉產(chǎn)品中克倫特羅的方法很多，包括：液相色譜法[6]、液質(zhì)聯(lián)用法[7]、氣質(zhì)聯(lián)用法[8-10]、酶聯(lián)免疫法（euzymelinked immunosorbent assay，ELISA）[11]等。酶聯(lián)免疫法假陽性較高，只能半定量，一般用于克倫特羅的快速檢驗(yàn)和大批量樣品的初篩實(shí)驗(yàn)。色譜法尤其是氣質(zhì)聯(lián)用法和液質(zhì)聯(lián)用法，為國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的確證方法，但它們的樣品前處理過程非常復(fù)雜，多采用固相萃取、液液萃取以及分子印跡[12]等技術(shù)，采用氣質(zhì)聯(lián)用對(duì)克倫特羅進(jìn)行檢測(cè)，還需要對(duì)克倫特羅衍生化。這些方法檢測(cè)成本高、試劑消耗量大、操作時(shí)間長。

1990年，Pawliszyn等[13]提出了集采樣、萃取、濃縮、進(jìn)樣于一體的固相微萃取（solid-phase microextraction，SPME）技術(shù)，無需溶劑，在水質(zhì)、土壤、食品檢測(cè)中得到了廣泛應(yīng)用。目前已有利用固相微萃取技術(shù)測(cè)定尿液及水中克倫特羅的報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)以肉產(chǎn)品為研究對(duì)象，研究固相微萃取結(jié)合氣質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)肉制品中克倫特羅的方法。該方法為保證定性、定量結(jié)果的可靠性，同時(shí)采用了穩(wěn)定性同位素稀釋技術(shù)?？藗愄亓_的萃取和衍生均在固相微萃取纖維頭的表面直接進(jìn)行，縮短了分析時(shí)間，提高了分析的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。

1材料與方法

1.1 材料與試劑

克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)品、D9-克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)品（100 ng/μL） 德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；N，O-雙-（三甲基硅氧基）三氟乙酰胺（BSTFA） 美國Supelco公司；鹽酸、乙酸鋅、氯化鈉、亞鐵氰化鉀和氫氧化鈉均為分析純。分析用水均為高純水。

1.2 儀器與設(shè)備

具有AOC5000自動(dòng)進(jìn)樣器的GCMS-QP2010氣質(zhì)聯(lián)用儀 日本島津公司； 85 μm 聚丙烯酸酯萃取頭（PA） 美國Supelco 公司；20mL頂空瓶 美國Alltech公司；磁性蓋（含PTFE/藍(lán)色硅膠20mm蓋墊） 德國CNW Technologles Gmbh。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取10 g樣品，然后加入20 mL 濃度為1 mol/L HCl溶液，同時(shí)加入150 μL 質(zhì)量濃度為1 mg/L的D9-克倫特羅內(nèi)標(biāo)液?；旌蟿驖{后，轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶，用少量HCl溶液清洗2至3次，在容量瓶中加入5 mL 的10.6 % （w/v）的亞鐵氰化鉀溶液和5 mL 21.9 % （w/v）的乙酸鋅溶液，用HCl溶液定容。過濾后，吸取10 mL濾液，加入頂空瓶中，滴加30 %的氫氧化鈉，至溶液出現(xiàn)渾濁，然后又消失為止。繼續(xù)加入4.5 g氯化鈉，使溶液過飽和，用純水定容至15 mL。在另一頂空瓶中加入100 μL衍生試劑，鉗緊瓶蓋后與樣品頂空瓶一起放入自動(dòng)SPME進(jìn)樣器中。

1.3.2 固相微萃取

選取PA纖維頭，采用頂空方式自動(dòng)萃取樣品。固相微萃取條件為：振蕩頻率504 r/min，萃取溫度90 ℃，萃取時(shí)間100 min。萃取完畢后，纖維頭移至衍生試劑頂空瓶中，在優(yōu)化條件下衍生。衍生完成后，直接進(jìn)樣，熱解析6 min。然后重復(fù)進(jìn)行下一個(gè)樣品的萃取。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：Rtx-5MS石英毛細(xì)柱（30 m×0.25 mm，0.25μm）；柱前壓552 KPa；進(jìn)樣口溫度260 ℃；程序升溫：初溫70 ℃，保持3 min，以18 ℃/min升至200 ℃，以58 ℃/min升至245 ℃，25℃/min升至280 ℃，保持2 min；解析時(shí)間6 min，不分流時(shí)間3 min；載氣He（純度99.999%）。

1.3.4 質(zhì)譜條件

監(jiān)測(cè)方式為選擇離子（Selected ion mode，SIM）方式，離子源溫度200 ℃，接口溫度230 ℃，溶劑延遲14 min。克倫特羅衍生物的選擇離子為定量離子m/z86，參考離子m/z187、243、262；內(nèi)標(biāo)物D9-克倫特羅衍生物的選擇離子為定量離子m/z95，參考離子m/z196、252、262；以定量離子的峰面積內(nèi)標(biāo)法定量。

2結(jié)果與分析

2.1 固相微萃取條件

對(duì)相關(guān)文獻(xiàn)[14]中固相微萃取法檢測(cè)克倫特羅的條件進(jìn)行改進(jìn)，以適應(yīng)自動(dòng)固相微萃取的要求。改進(jìn)后的條件為：振蕩頻率504 r/min，萃取溫度90 ℃，萃取時(shí)間100 min?？藗愄亓_在堿性水溶液中為中等極性半揮發(fā)性化合物，適合采用85 μm PA纖維頭進(jìn)行固相微萃取。為保證溶液的堿性條件，用氫氧化鈉調(diào)整，其最終的pH值約為14。在強(qiáng)堿性條件下，如果采用纖維頭直接萃取方式，會(huì)影響纖維頭壽命，因而本實(shí)驗(yàn)采取頂空方式進(jìn)行萃取，以避免纖維頭表面與強(qiáng)堿溶液的直接接觸。

2.2 衍生條件的選擇及優(yōu)化

采用氣質(zhì)聯(lián)用法測(cè)定克倫特羅，必須對(duì)克倫特羅進(jìn)行衍生。常規(guī)衍生反應(yīng)是將克倫特羅與BSTFA在密閉反應(yīng)瓶內(nèi)進(jìn)行。反應(yīng)時(shí)間長，容易受環(huán)境影響，，只要微量水分進(jìn)入反應(yīng)瓶，就能引起衍生化反應(yīng)的失敗。

本實(shí)驗(yàn)利用自動(dòng)固相微萃取裝置，將SPME纖維頭自動(dòng)插入充滿BSTFA蒸汽的頂空瓶中直接衍生。這種在線衍生技術(shù)的實(shí)現(xiàn)，使得BSTFA蒸汽直接和SPME纖維頭表面吸附的克倫特羅接觸。由于氣體擴(kuò)散速度快，因而衍生反應(yīng)時(shí)間可以大大減少。影響在線衍生的因素有衍生時(shí)間、衍生溫度及頂空瓶的振蕩頻率，可以分別進(jìn)行優(yōu)化。

將30 μL克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)液加入頂空瓶中，同時(shí)加入4.5 g氯化鈉，純水定容至15 mL，氫氧化鈉調(diào)pH至14。SPME條件為：萃取溫度70 ℃，萃取時(shí)間60 min，振蕩頻率500 r/min。SPME結(jié)束后，纖維頭自動(dòng)進(jìn)入含100 μL BSTFA的頂空瓶中，優(yōu)化衍生溫度、衍生時(shí)間和振蕩頻率對(duì)衍生效率的影響。

2.2.1 振蕩頻率對(duì)衍生效率的影響

圖1 振蕩頻率對(duì)衍生效率的影響。

Fig.1 Effect of Agitation speed on the derivation efficiency.

在衍生時(shí)間20 min，衍生溫度70 ℃條件下，考察振蕩頻率對(duì)衍生效率的影響。振蕩頻率能夠影響衍生試劑在頂空瓶中的揮發(fā)及在纖維頭表面的擴(kuò)散速度，同時(shí)也影響了衍生產(chǎn)物從纖維頭表面擴(kuò)散到頂空瓶的速度，因而振蕩頻率對(duì)衍生效率的影響有一個(gè)最佳值。由圖1可知，隨著振蕩頻率的增加，響應(yīng)值先升高，再降低，響應(yīng)最高的振蕩頻率為500 r/min。

2.2.2 衍生時(shí)間對(duì)衍生效率的影響

圖2 衍生時(shí)間對(duì)衍生效率的影響。

Fig.2 Effect of derivation time on the derivation efficiency.

在衍生溫度為70 ℃，振蕩頻率為500 r/min條件下考察衍生時(shí)間對(duì)衍生效率的影響。由圖2可知，衍生時(shí)間的增加提高了克倫特羅衍生效率。最優(yōu)衍生時(shí)間為20 min。20 min后衍生效率隨著時(shí)間的增加雖有提高，但變化很小。

2.2.3 衍生溫度對(duì)衍生效率的影響

圖3 衍生溫度對(duì)衍生效率的影響。

Fig.3 Effect of derivation temperature on the derivation efficiency.

在振蕩頻率500 r/min、衍生時(shí)間20 min的條件下，考察衍生溫度下對(duì)衍生效率的影響。由圖3 可知，克倫特羅衍生物在色譜圖上的響應(yīng)值隨著溫度升高而增大，80 ℃時(shí)最高，然后緩慢降低，從85～90 ℃，響應(yīng)值急劇下降。由此可知衍生溫度對(duì)衍生效率影響較大。最優(yōu)衍生溫度為80 ℃。

綜上可知，最優(yōu)衍生條件為衍生振蕩頻率500 r/min，衍生溫度80 ℃，衍生時(shí)間20 min，。

2.3 線性和最低檢出限

在陰性樣品中準(zhǔn)確添加克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)溶液，使其最終含量分別為 2.5、12.5、50、75、150、250 μg/kg，按1.3節(jié)進(jìn)行樣品前處理及SPME，并按優(yōu)化后的條件在線衍生，用氣質(zhì)聯(lián)用儀測(cè)定，考察其線性?？藗愄亓_的含量（y）和克倫特羅與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值（x）之間線性關(guān)系良好，線性方程為y=79.79x―4.15，相關(guān)系數(shù)r2 = 0.9993，最低檢出限0.48 μg/kg（RSN=3），最小定量檢出限1.59 μg/kg（RSN=10）。

2.4精密度與回收率

按上述條件平行測(cè)定6個(gè)陽性樣品，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為7.1%。

在樣品中添加克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)溶液，加標(biāo)濃度分別為2.5、75、150 μg/ kg，按本文條件每個(gè)樣品平行測(cè)定3次，所得結(jié)果見表1。平均回收率為96%～104%。圖4為加標(biāo)樣品選擇離子色譜圖，克倫特羅和D9-克倫特羅峰形尖銳、對(duì)稱，響應(yīng)較好。

圖4 加標(biāo)樣品中克倫特羅衍生物和D9-克倫特羅衍生物的選擇離子色譜圖

Fig.4 Chromatogram of clenbuterol BSTFA derivative and D9-clenbuterol BSTFA derivativselected ions in

spiked samples

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)采用自動(dòng)固相微萃取結(jié)合氣質(zhì)聯(lián)用法對(duì)肉產(chǎn)品中的克倫特羅進(jìn)行了檢測(cè)，方法快速、準(zhǔn)確，檢測(cè)時(shí)間由國標(biāo)方法的8 h縮短至2 h，實(shí)現(xiàn)了檢測(cè)過程的自動(dòng)化。檢測(cè)過程中不需要有機(jī)試劑，因而消除了有機(jī)試劑對(duì)環(huán)境的污染，降低了檢測(cè)成本，具有很好的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

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