PYGM基因SNP及單體型多態(tài)性與女子長跑運(yùn)動(dòng)員生理表型的關(guān)聯(lián)性

吳劍等

摘 要：目的：探討PYGM基因SNP及單體型多態(tài)性與女子長跑運(yùn)動(dòng)員生理表型的關(guān)聯(lián)性。方法：研究對(duì)象為我國備戰(zhàn)2012年倫敦奧運(yùn)會(huì)國家集訓(xùn)隊(duì)的79名女子長跑運(yùn)動(dòng)員。對(duì)PYGM基因的rs483962、rs490980和rs589691 3個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行基因型和單體型分析；并研究基因型和單體型與各生理表型指標(biāo)的關(guān)聯(lián)性。結(jié)果：1）rs490980位點(diǎn)不同基因型與運(yùn)動(dòng)員O2AT/W顯著相關(guān)（P<0.05），CC型顯著性低于TT型和TC型；rs589691位點(diǎn)不同基因型與運(yùn)動(dòng)員WHR顯著相關(guān)，CC型顯著性低于TC型和TT型；2）由rs490980-rs589691位點(diǎn)組成的單體型與WHR顯著性相關(guān)，TT單體型攜帶者WHR顯著性高于非TT單體型攜帶者。結(jié)論：1）PYGM基因rs490980位點(diǎn)可以作為與有氧運(yùn)動(dòng)能力表型有關(guān)聯(lián)性的基因標(biāo)記； 2）PYGM基因rs589691位點(diǎn)和rs490980-rs589691位點(diǎn)組成的單體型可以作為與身體成分有關(guān)聯(lián)性的基因標(biāo)記。

關(guān)鍵詞： PYGM基因；SNP；單體型；生理表型；關(guān)聯(lián)性研究

中圖分類號(hào)： G 804.2 文章編號(hào)：1009-783X（2014）04-0376-04 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

Abstract：Objective：To explore the association of polymorphisms in PYGM gene with the physiological phenotypes of female long-distance athletes.Methods：We examined the genotypes and haplotypes in SNPs （rs483962，rs490980 and rs589691） of PYGM gene，and used one-way analysis of variance to find the association between the polymorphisms and physiological phenotypes in 79 female long-distance athletes who were preparing for London Olympic Games.Results：The individuals with rs490980-CC genotype had lower O2AT/W than TT and TC.The rs589691 was associated with WHR，those carried CC genotype had lower WHR.The rs490980-rs589691 haplotype was associated with WHR，the individuals with TT haplotype had higher WHR than others.Conclusion：rs490980 may serve as molecular marker associated with aerobic endurance capability phenotypes.rs589691 and rs490980-rs589691 haplotype were associated with body composition phenotypes.

Keywords：PYGM gene； SNP； haplotype； physiological phenotypes； association study

糖原是能量的主要儲(chǔ)備形式。糖原磷酸化酶（GP）是糖原代謝過程中的限速酶，使糖原分解釋放出1-磷酸葡萄糖（G-1-P）。人類糖原磷酸化酶從20世紀(jì)30年代開始一直被研究者重視，根據(jù)其功能、結(jié)構(gòu)及組織分布特性主要分為3種亞型，即肌型（Muscle-type GP，PYGM）、肝型（Liver-type GP，PYGL）與腦型（Brain-type GP，BGP或PYGB）[1-3]。肌肉中僅存在M型磷酸化酶，為肌肉收縮提供能量，稱為肌肉磷酸化酶（PYGM），而其他組織中含有2種以上的同工酶[4]。肌肉磷酸化酶的主要作用為水解肌糖原支鏈的α-1，4糖苷鍵，產(chǎn)物為1-磷酸葡萄糖，后者轉(zhuǎn)化為6-磷酸葡萄糖，進(jìn)一步生成丙酮酸。有氧代謝時(shí)，丙酮酸進(jìn)入線粒體生成乙酰輔酶A，再通過三羧酸循環(huán)產(chǎn)生大量三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）；而無氧酵解時(shí)，丙酮酸則生成乳酸和少量ATP[5]。

PYGM基因位于染色體11q12-13.2，由2523個(gè)堿基對(duì)組成，分為20個(gè)內(nèi)含子和12個(gè)外顯子[6]。該基因的遺傳性缺失可引發(fā)一種典型的代謝性肌病—McArdle病，該病的特征為20～30歲起病，表現(xiàn)為運(yùn)動(dòng)不耐受、疲勞、肌痛及運(yùn)動(dòng)時(shí)肌肉痙攣，有時(shí)有反復(fù)發(fā)作的肌紅蛋白尿，由此推測其基因多態(tài)性可能與運(yùn)動(dòng)能力有一定的關(guān)聯(lián)性。

PYGM在肌肉能量代謝中有重要作用，但迄今尚未見其與優(yōu)秀有氧運(yùn)動(dòng)能力表型相關(guān)的報(bào)道。研究選擇優(yōu)秀長跑運(yùn)動(dòng)員作為研究對(duì)象，根據(jù)以往研究報(bào)道及在中國人群中的分布頻率，選擇位于基因5′端非編碼區(qū)啟動(dòng)子區(qū)域的rs483962和第4、5內(nèi)含子內(nèi)的rs490980、rs589691 3個(gè)單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)（single nucleotide polymorphism，SNP）進(jìn)行基因型分析。這3個(gè)位點(diǎn)是位于不同的單體型區(qū)塊的tagSNP（標(biāo)簽SNP），可以代表不同單體型區(qū)塊的信息；然后根據(jù)PYGM的功能，對(duì)研究對(duì)象的相關(guān)生理表型指標(biāo)進(jìn)行測試，以期尋找PYGM基因多態(tài)性與優(yōu)秀有氧運(yùn)動(dòng)能力表型的相關(guān)性。

2 研究對(duì)象與方法

2.1 研究對(duì)象

我國備戰(zhàn)2012年倫敦奧運(yùn)會(huì)國家集訓(xùn)隊(duì)的女子長跑運(yùn)動(dòng)員79名，分別來自山東、河北、河南、內(nèi)蒙古和北京共5個(gè)省市區(qū)專業(yè)隊(duì)， 北京體育大學(xué)和北京航空航天大學(xué)長跑隊(duì)，北京遠(yuǎn)中田徑俱樂部女子長跑隊(duì)。研究對(duì)象總?cè)藬?shù)占2010年我國長跑項(xiàng)目注冊運(yùn)動(dòng)員總?cè)藬?shù)的83%，集中了我國目前女子長跑項(xiàng)目成年與青年運(yùn)動(dòng)員群體。2010年全國田徑錦標(biāo)賽上獲取長跑各單項(xiàng)前8名的運(yùn)動(dòng)員中有92%被納入本研究，基本覆蓋了長跑項(xiàng)目全部優(yōu)秀運(yùn)動(dòng)員，運(yùn)動(dòng)員基本情況見表1。

2.2 研究方法

2.2.1 表型指標(biāo)的測定

按照指標(biāo)所反映的功能，共分為以下2類，采集方法略。

有氧運(yùn)動(dòng)能力相關(guān)指標(biāo)：無氧閾攝氧量（O2AT）、相對(duì)無氧閾速度（O2AT/W）、無氧閾心率（HRAT）、無氧閾速度（VAT）、最大攝氧量（O2max）、相對(duì)最大攝氧量（O2max/W）、無氧閾攝氧量/最大攝氧量（O2AT/O2max）、最大心率（HRmax）、最大跑速（VO2max）；

身體成分相關(guān)指標(biāo)：體脂百分比、身高/體質(zhì)量百分比、托克來指數(shù)、體格指數(shù)、體重指數(shù)、腰臀比、皮褶厚度總和、肱三頭肌處皮褶、肩胛下角處皮褶、腹部皮褶、髂嵴處皮褶、小腿三頭肌處皮褶。

2.2.2 基因多態(tài)性分析

取5 mL受試者靜脈血，收集于抗凝管；Promaga公司基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA；保存于-70 ℃環(huán)境中。

采用基質(zhì)輔助激光解析/電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)（matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI- TOFMS）對(duì)SNP位點(diǎn)進(jìn)行基因解析。PCR引物和單堿基延伸引物由Assay Designer（Sequenom）軟件包設(shè)計(jì)。所有需要分型的DNA 樣本都稀釋到5 ng/μL。取1 μL DNA樣本，將其與0.95 μL水、0.625 μL PCR緩沖液（含MgCl2 15 mmol/L）、1 μL的dNTP 2.5 mmol/L、0.325 μL的MgCl2 25 mmol/L、1 μL PCR引物及0.1 μL HotStar Taq酶（Qiagen）混合在一起。PCR 反應(yīng)條件：94 ℃ 15 min；94 ℃ 20 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共45個(gè)循環(huán)；最終72 ℃ 3 min。PCR擴(kuò)增后，剩余的dNTP將被去磷酸消化掉，反應(yīng)體系包括1.53 μL水、0.17 μL SAP緩沖液、0.3U堿性磷酸酶（Sequenom）。該反應(yīng)在37 ℃進(jìn)行40 min，然后85 ℃ 5 min使酶失活。堿性磷酸酶處理后，針對(duì)SNP的單堿基延伸引物在下列反應(yīng)體系中進(jìn)行：0.755 μL水、0.2 μL 10X iPLEX緩沖液、0.2 μL終止混合物、0.041 μL iPLEX酶 （Sequenom），0.804 μL 10 μ mmol/L 的延伸引物。單堿基延伸反應(yīng)在下列條件下進(jìn)行：94 ℃ 30 s；94 ℃ 5 s，52 ℃ 5 s，80 ℃ 5 s 5個(gè)循環(huán)，共40個(gè)循環(huán)；最后72 ℃ 3 min。在終止反應(yīng)物中加入6 mg陽離子交換樹脂（Sequenom）脫鹽，混合后加入25 μL水懸浮。使用MassARRAY Nanodispenser （Sequenom） 將最終的分型產(chǎn)物點(diǎn)樣到一塊384孔的spectroCHIP （Sequenom）上，并用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜進(jìn)行分析。最終結(jié)果由MassARRAY RT軟件系統(tǒng)實(shí)時(shí)讀取，并由MassARRAY Typer軟件系統(tǒng)完成基因分型分析。

2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法

Shesis在線軟件對(duì)各多態(tài)位點(diǎn)進(jìn)行哈溫平衡檢驗(yàn)。單個(gè)SNP位點(diǎn)不同基因型之間各生理表型指標(biāo)的差異以表型指標(biāo)為變量進(jìn)行單因素方差分析。統(tǒng)計(jì)分析由SPSS軟件完成，顯著性水平定為P<0.05。

Shesis在線軟件計(jì)算同一基因不同位點(diǎn)間的D′和r2，以度量對(duì)應(yīng)位點(diǎn)間的LD緊密程度，并計(jì)算單體型頻率。多個(gè)位點(diǎn)的單體型分析采用R-平臺(tái)下的haplo.stat軟件。以生理表型指標(biāo)為變量進(jìn)行單因素方差分析，統(tǒng)計(jì)分析不同單體型與各指標(biāo)的關(guān)聯(lián)性，統(tǒng)計(jì)分析由SPSS軟件完成，顯著性水平定為P<0.05。人數(shù)過低的單體型與相近單體型組進(jìn)行合并，3種以下單體型的統(tǒng)計(jì)分析使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。

3 結(jié)果

3.1 PYGM基因單個(gè)位點(diǎn)多態(tài)性與生理指標(biāo)的關(guān)聯(lián)性

分析PYGM基因3個(gè)多態(tài)位點(diǎn)不同基因型與有氧運(yùn)動(dòng)能力指標(biāo)的關(guān)聯(lián)性，結(jié)果顯示：rs490980位點(diǎn)不同基因型與運(yùn)動(dòng)員O2AT/W顯著相關(guān)，CC型顯著性低于TT型和TC型；rs589691位點(diǎn)不同基因型與運(yùn)動(dòng)員WHR顯著相關(guān)， CC型顯著性低于TC型和TT型，見表2。

4 討論

4.1 PYGM基因與有氧運(yùn)動(dòng)能力相關(guān)指標(biāo)的相關(guān)性

研究結(jié)果顯示：PYGM基因rs490980位點(diǎn)不同基因型與運(yùn)動(dòng)員O2AT/W顯著相關(guān)，CC型顯著性低于TT型和TC型。

運(yùn)動(dòng)員的生理機(jī)能一直是長跑項(xiàng)目研究的核心問題，其中有氧運(yùn)動(dòng)能力中的O2max、AT和RE被認(rèn)為是決定運(yùn)動(dòng)成績的3大主要因素[7]。目前大多數(shù)研究者認(rèn)為，運(yùn)動(dòng)員有氧耐力的提高并不完全是O2max增長的結(jié)果，和AT的提高有密切關(guān)系，甚至后者關(guān)系更大。有人發(fā)現(xiàn)，有氧耐力好的運(yùn)動(dòng)員，AT出現(xiàn)得晚。如速度性運(yùn)動(dòng)員AT值為50%～60%O2max，而耐力運(yùn)動(dòng)員AT值則可為80%～90%O2max[8]。本實(shí)驗(yàn)室前期的研究的測試結(jié)果頁顯示：優(yōu)秀運(yùn)動(dòng)員在AT和O2max水平下的多項(xiàng)指標(biāo)均顯著優(yōu)于一般運(yùn)動(dòng)員，與馮美云對(duì)2004年奧運(yùn)會(huì)國家集訓(xùn)隊(duì)的研究結(jié)果相一致，證明O2AT能夠準(zhǔn)確和真實(shí)地反映運(yùn)動(dòng)員的機(jī)能水平。

PYGM是糖原代謝過程中的限速酶，其表達(dá)降低會(huì)造成糖原代謝障礙，從而影響運(yùn)動(dòng)能力。由于未見到國內(nèi)外對(duì)rs490980位點(diǎn)基因型與有氧運(yùn)動(dòng)能力表型的相關(guān)研究，因此，無法確認(rèn)其對(duì)表型的具體影響。分析認(rèn)為，該位點(diǎn)位于PYGM基因Intron4位置，內(nèi)含子為非編碼蛋白的序列。近幾年的研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)含子是基因組中的一種重要元件，對(duì)內(nèi)含子的功能提出了許多新的見解：內(nèi)含子在維持染色體的特定結(jié)構(gòu)、基因的特定功能方面有重要作用；內(nèi)含子在進(jìn)化過程中通過“外顯子改組”的作用在基因的進(jìn)化中起作用；內(nèi)含子還對(duì)基因的表達(dá)起調(diào)控作用[9]。本研究認(rèn)為，rs490980位點(diǎn)多態(tài)性可能對(duì)PYGM mRNA的表達(dá)有一定影響，從而影響了代謝過程，產(chǎn)生了不同基因型O2AT/W的差異性。

4.2 PYGM基因與身體成分相關(guān)指標(biāo)的關(guān)聯(lián)性

研究結(jié)果顯示：PYGM基因rs589691位點(diǎn)不同基因型與運(yùn)動(dòng)員WHR顯著相關(guān)，CC型顯著性低于TT型和TC型；單體型方面，PYGM基因2-3位點(diǎn)單體型與運(yùn)動(dòng)員WHR顯著相關(guān)，TT單體型個(gè)體顯著性低于非TT單體型個(gè)體。

腰臀比（WHR）是腰圍和臀圍的比值，是判定中心性肥胖的重要指標(biāo)。腰臀比可作為獨(dú)立客觀反映身體脂肪分布特征的體成分指標(biāo)：腰臀比越大，體重越大，腹部皮褶越厚；腰臀比增大其血壓升高趨勢顯著，心肺功能也越差；腰臀比增大能使力量、柔韌性、平衡能力、靈敏和反應(yīng)能力下降[10]。

人體的運(yùn)動(dòng)需要能量，機(jī)體的新陳代謝過程中，同樣也需要能量。細(xì)胞代謝直接利用能源來自于ATP的分解產(chǎn)生，ATP的合成需要的能量最終主要是由糖的分解代謝提供。運(yùn)動(dòng)中血糖濃度保持相對(duì)恒定，隨著運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度的增加，血糖產(chǎn)生與血糖的利用呈平行性變化。運(yùn)動(dòng)中肌糖原的分解調(diào)節(jié)，主要是肌肉收縮，肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度增加，Ca2+可以激活磷酸化酶b激酶而提高糖原磷酸化酶的活性，其次是激素尤其是腎上腺素，通過與肌細(xì)胞膜的a受體結(jié)合，使細(xì)胞內(nèi)的環(huán)磷酸腺苷增加，經(jīng)過一系列的化學(xué)變化，導(dǎo)致糖原磷酸化酶的活性升高，促進(jìn)糖原的分解；因此，PYGM對(duì)于機(jī)體的糖代謝有重要作用，其活性直接影響集體的新陳代謝過程。

在人類基因組中，相鄰近的SNPs等位基因并不是隨機(jī)組合的，而是傾向于以一個(gè)整體遺傳給后代，染色體上一系列緊密連鎖并共同遺傳的遺傳標(biāo)記稱為單體型（haplotype）[11-12] 。如果一個(gè)單體型有n個(gè)變異位點(diǎn)，理論上就可能有2n種可能的單體型；但實(shí)際上，大多數(shù)染色體區(qū)域只有少數(shù)幾個(gè)常見的單體型，它們的模式變化較少且有種族特異性，并且同種族個(gè)體中有80%～90%的單體型是一致的，因此，代表了一個(gè)群體中的大部分多態(tài)性。由于單體型內(nèi)部緊密連鎖且變化較少，因此，可以通過tagSNP代表絕大多數(shù)常見的單體型，從而大大降低了SNP分析的數(shù)量[13]。

應(yīng)用tagSNPs構(gòu)建單體型可以有效地覆蓋影響表型的常見單體型。復(fù)雜表型一般與多個(gè)位點(diǎn)的變異有關(guān)，同一個(gè)基因上特定等位基因的不同組合對(duì)蛋白合成轉(zhuǎn)錄水平有不同的影響，因此，單體型分析十分重要。單體型和連鎖不平衡分析的方法在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域遺傳疾病的相關(guān)研究中已經(jīng)被大量應(yīng)用，在運(yùn)動(dòng)分子生物學(xué)的研究中也在逐步被引入。本文選擇的位于基因第4、5內(nèi)含子內(nèi)的rs490980、rs589691 2個(gè)位點(diǎn)，是位于不同的單體型區(qū)塊的tagSNP，可以比較好的代表該區(qū)域的分子遺傳特征。

研究表明：存在于基因的編碼區(qū)或非編碼區(qū)的基因多態(tài)位點(diǎn)，可以從功能上直接影響相關(guān)基因的表達(dá)，也可以與真正的影響功能的基因處于連鎖狀態(tài)，成為有效的分子標(biāo)記。由于編碼區(qū)的突變常常會(huì)引起蛋白結(jié)構(gòu)的變化，因此，位于編碼區(qū)非同義突變的多態(tài)位點(diǎn)相對(duì)較少，而位于非編碼區(qū)的多態(tài)性在基因的表達(dá)中起重要調(diào)控作用。rs589691位于PYGM基因Intron5，rs490980-rs589691單體型的2個(gè)組成位點(diǎn)也均位于PYGM基因的內(nèi)含子位置，屬于基因的非編碼區(qū)。由此分析上述幾個(gè)位點(diǎn)可能對(duì)基因表達(dá)有一定的調(diào)控作用，從而影響了PYGM的功能和活性，與身體的能量代謝有一定的關(guān)聯(lián)性；但上述位點(diǎn)的生物學(xué)功能和對(duì)PYGM基因表達(dá)影響的具體機(jī)制，還需應(yīng)用誘導(dǎo)蛋白表達(dá)等方法進(jìn)一步進(jìn)行研究。

5 結(jié)論

PYGM基因rs490980位點(diǎn)CC基因型顯著性低于TT型和TC型，可以作為有氧運(yùn)動(dòng)能力表型有關(guān)聯(lián)性的基因標(biāo)記。

PYGM基因rs589691位點(diǎn)CC基因型的WHR顯著性低于TT型和TC型；rs490980-rs589691位點(diǎn)TT單體型個(gè)體的WHR顯著性低于非TT單體型個(gè)體，該基因型和單體型可以作為與身體成分有關(guān)聯(lián)性的基因標(biāo)記。

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