云南陸稻品種抗瘟性鑒定及其與抗旱性的相關(guān)分析

徐建欣 楊潔 祥偉等

摘 要 為了明確陸稻在不同逆境脅迫下的抗性表現(xiàn)，利用云南省4個(gè)稻瘟病菌優(yōu)勢(shì)小種對(duì)30個(gè)云南陸稻品種進(jìn)行抗稻瘟病鑒定，并對(duì)其進(jìn)行抗旱性評(píng)價(jià)及SSR多樣性分析。結(jié)果表明：抗病能力中等以上品種占所檢測(cè)品種的60%，抗旱能力中等以上品種占所有供試品種的66.7%，平均有效等位基因數(shù)為1.097 5、Neis基因多樣性指數(shù)（H）平均為0.077 8；相關(guān)分析結(jié)果顯示，供試品種的抗瘟性與抗旱性間存在顯著的相關(guān)關(guān)系。本研究結(jié)果表明，供試品種間存在豐富的遺傳多樣性變異，且在面臨不同逆境脅迫時(shí)具有相近的抗性表現(xiàn)，使得育種過程中培育兼具較好抗瘟、抗旱能力的栽培稻新品種成為可能。

關(guān)鍵詞 陸稻；稻瘟病抗性；抗旱性；SSR分子標(biāo)記

中圖分類號(hào) S332.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

植物對(duì)逆境的抵抗和耐受能力稱之為抗逆性，即植物在長(zhǎng)期演化過程中形成的對(duì)不良環(huán)境的適應(yīng)性，這些不良環(huán)境包括干旱、高溫、鹽脅迫、低溫、病原物入侵等多種形式[1-3]。植物在整個(gè)生命周期中，一直處于變化著的環(huán)境中。適宜的環(huán)境條件能保證植物正常的生長(zhǎng)發(fā)育，而不適宜的生物或非生物逆境條件則會(huì)抑制植物的生長(zhǎng)，甚至使植物死亡。稻瘟病是世界水稻生產(chǎn)最具有毀滅性的病害之一。稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）生理小種的多樣性、致病力的多樣性和極易變異性是稻瘟病難以控制的主要原因[4-7]。干旱是植物生長(zhǎng)和農(nóng)作物產(chǎn)量影響最為明顯的非生物逆境環(huán)境因子之一，由此產(chǎn)生的非生物脅迫是引起全球糧食作物減產(chǎn)的重要原因，從而造成了許多重要糧食作物大量減產(chǎn)[8]。 陸稻具有較好的抗稻瘟病能力， 張啟星等[9]對(duì)河北省地方陸稻品種的抗病性研究后發(fā)現(xiàn)，陸稻品種在抗稻瘟病頻度和強(qiáng)度上均高于當(dāng)?shù)厮酒贩N。近年來，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)陸稻抗旱性研究主要集中在水分脅迫對(duì)陸稻植株的傷害機(jī)理[10-12]、陸稻抗旱的生理生化機(jī)制[13]、抗旱性鑒定方法與指標(biāo)上[14]，而在涉及抗旱性狀相關(guān)的基因工程研究及抗旱性遺傳與育種研究上則剛剛起步。

本研究以云南陸稻品種為材料，通過對(duì)供試品種進(jìn)行苗期稻瘟病抗性鑒定、早期抗旱性評(píng)價(jià)與遺傳多樣性分析，試圖探討云南陸稻品種抗病性、抗旱性與遺傳多樣性三者之間的關(guān)系，以期能為陸稻抗逆性研究及優(yōu)良親本的選育提供一定的幫助。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試植物 本實(shí)驗(yàn)所用的植物來源于云南省5個(gè)州/市、10個(gè)縣/區(qū)的30個(gè)陸稻品種，其品種名稱、來源詳見表1。

1.1.2 供試菌株 選用近年來云南省稻區(qū)稻瘟病菌優(yōu)勢(shì)小種為致病菌株：1個(gè)小種（ZB15）來自秈稻區(qū)，3個(gè)小種（ZD3、ZE1和ZE3）來自粳稻區(qū)。

1.2 方法

1.2.1 稻瘟病抗性鑒定 供試品種先浸種24 h，再用2%的福爾馬林（40%的甲醛溶液）消毒2 h，然后用自來水沖洗干凈，于35 ℃的溫度條件下進(jìn)行催芽，露白后播種于育種盆內(nèi)，每盆種5個(gè)陸稻品種和1個(gè)感病對(duì)照品種（麗江新團(tuán)黑谷），每穴種15粒左右，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。在溫室中育苗，稻苗長(zhǎng)至四葉一心時(shí)，采用人工接種法對(duì)供試品種進(jìn)行稻瘟病抗性鑒定。

選用混合菌株進(jìn)行接種。產(chǎn)孢培養(yǎng)2～3 d后，用0.2%吐溫20（Tween20）溶液將病菌孢子從培養(yǎng)皿表面沖洗入燒杯內(nèi)，配置成混合孢子懸浮液（濃度為106孢子/mL），菌液濃度為100倍顯微鏡下30～50個(gè)孢子/視野。用空氣壓縮機(jī)連接噴霧器在接種箱中噴霧接種，接種后黑暗保濕24 h，輔以噴水保濕，促進(jìn)病害的發(fā)生。接種后7～10 d觀察記載發(fā)病情況，待感病對(duì)照品種的病情達(dá)9級(jí)時(shí)，按中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（2003）調(diào)查記載病情（表2）[15]。

1.2.2 抗旱性鑒定 在直徑為90 mm的培養(yǎng)皿底部墊上圓形濾紙，每皿放50粒種子，再加PEG溶液20 mL，加液蓋好后置28 ℃左右發(fā)芽，PEG溶液設(shè)置0%、15% 2個(gè)水平，設(shè)置3個(gè)重復(fù)，5 d后測(cè)量其相對(duì)幼芽粗度（Relative germ roughness， RGR）、相對(duì)幼根長(zhǎng)度（Relative radicle length， RRL）和相對(duì)幼根粗度（Relative radicle roughness， RRR）。

1.2.3 遺傳多樣性分析 ①陸稻基因組DNA的提?。宏懙居酌玳L(zhǎng)到三葉一心期剪取葉片，利用CTAB法[16]提取每個(gè)品種的10個(gè)單株的全基因組DNA，采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA濃度。加入去離子雙蒸水稀釋至25 ng/μL，于-20 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

②SSR-PCR的擴(kuò)增：選取均勻分布在水稻12條染色體上的24對(duì)多態(tài)性高、條帶清晰、穩(wěn)定性好的引物對(duì)供試品種進(jìn)行SSR-PCR擴(kuò)增。20 μL反應(yīng)體系包括：1×PCR buffer，0.2 mmol/L dNTPs，1.68 mmol/L MgCl2，0.5 mmol/L的SSR引物，25 ng DNA模板及1 U Taq酶。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性 5 min；然后94 ℃ 40 s，55 ℃ 30 s、72 ℃ 40 s，42個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min，產(chǎn)物于4 ℃保存?zhèn)溆?，反?yīng)在Eppendorf PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行。PCR產(chǎn)物進(jìn)行6%聚丙烯酰胺凝膠電泳，恒定電壓100 V，電泳2.5 h，經(jīng)銀染、顯影后，拍照貯存?zhèn)溆肹17-18]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

1.3.1 抗旱性數(shù)據(jù)分析 相對(duì)值=脅迫測(cè)定值/對(duì)照測(cè)定值，陸稻抗旱性評(píng)價(jià)方法采用抗旱性隸屬函數(shù)法[19]。

Xij=

式中Xij為i品種j性狀值，Xmin為j性狀中最小值，Xmax為j性狀中最大值，Xij為i品種j性狀的抗旱隸屬值。然后將品種所有性狀的抗旱隸屬值進(jìn)行累加，求其平均數(shù)。

Xi=Xij

式中Xi是i品種的抗旱隸屬函數(shù)值，Xi大的抗旱性強(qiáng)，并規(guī)定抗旱程度的指標(biāo)值為：當(dāng)Xi≥0.80為強(qiáng)抗，0.50

1.3.2 遺傳多樣性數(shù)據(jù)分析 每對(duì)SSR引物檢測(cè)1個(gè)座位，每條多態(tài)性條帶記為1個(gè)等位基因，采用采用AA、BB或CC（純合型）和AB或BC（雜合型）的方法統(tǒng)計(jì)條帶。用PopGene 1.32[20]分析等位基因數(shù)（Na）、有效等位基因數(shù)（Ne）、香濃指數(shù)（Ⅰ）、觀察雜合度（Ho）、期望雜合度（He）、Neis基因多樣性指數(shù)（H）。相關(guān)分析使用Minitab15軟件[21]進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 陸稻品種人工接種的測(cè)定

2.2 抗旱性鑒定

1個(gè)、中抗品種5個(gè)、低抗品種4個(gè)，紅河州擁有中抗品種1個(gè)。

2.3 遺傳多樣性分析

30個(gè)陸稻品種間也存在相當(dāng)大的遺傳多樣性變異，其中Ne的變化幅度為0.099 6～1.462 2，平均Ne為1.097 5；I的變化幅度為0.000 0～0.396 8，平均I為0.128 2；Ho的變化幅度為0.000 0～0.034 8，平均Ho為0.002 8；He變化幅度為0.000 0～0.258 1，平均He為0.081 8；H的變幅為0.000～0.245 2，平均H為0.077 8（表4）。

2.4 相關(guān)性分析

3 討論與結(jié)論

物種遺傳多樣性豐富、群體穩(wěn)定、抗逆性和抗病性較強(qiáng)[22]。而本研究結(jié)果卻顯示供試陸稻品種的遺傳多樣性與稻瘟病抗性和抗旱性之間無顯著相關(guān)性，究其原因可能是本研究所選用的SSR標(biāo)記為中性標(biāo)記，反映的是基因組背景上的多態(tài)性，與功能基因多不連鎖，即與表型不直接相關(guān)[23]。植物表現(xiàn)抗逆性是環(huán)境、植物自身和脅迫條件相互作用的結(jié)果，而SSR分子標(biāo)記只是基因組中的一些片段，難以反映其抗性表現(xiàn)的全貌。

本研究供試品種的病害級(jí)別與抗旱隸屬函數(shù)值之間卻存在一個(gè)極顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系，表明抗病能力越強(qiáng)的品種，在干旱脅迫下越能夠表現(xiàn)出更好的抗旱能力。此現(xiàn)象的原因可能是因?yàn)橹参镌诔惺芨鞣N逆境脅迫條件時(shí)，存在某些共同的分子調(diào)節(jié)機(jī)制。例如在脅迫信號(hào)的感應(yīng)和轉(zhuǎn)導(dǎo)方面，脫落酸（Absicisic acid，ABA）是一種小分子親脂性的植物激素，具有調(diào)節(jié)植物發(fā)育、種子休眠、發(fā)芽、細(xì)胞分裂和在細(xì)胞水平上具有對(duì)干旱、寒冷、鹽堿、病害和紫外輻射等環(huán)境脅迫的響應(yīng)能力[24-25]；促分裂原激活蛋白激酶（MAPK）級(jí)聯(lián)信號(hào)通路在抵抗植物的非生物和生物脅迫中也都發(fā)揮了重要的作用，大量的研究表明激素、非生物脅迫、病原物、病原物激發(fā)子在發(fā)育的特定階都能激活植物中的MAPK途徑[26]，水稻中OsMAPK5a在接種稻瘟病病菌時(shí)其表達(dá)上調(diào)，其活性可被ABA、茉莉酸（JA）等各種生物脅迫、非生物脅迫所激活，其超量表達(dá)增加了水稻對(duì)干旱脅迫的耐受性[27]。在基因的調(diào)控表達(dá)方面，自從l987年P(guān)az-Ares等[28]首次報(bào)道玉米轉(zhuǎn)錄因子基因的克隆以來，相繼從高等植物中分離出的調(diào)控植物干旱、高鹽、低溫、激素、病原脅迫反應(yīng)及生長(zhǎng)發(fā)育等相關(guān)基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子己達(dá)數(shù)百種[29-30]，如AP2/EREBP、bZIP、MYB和wRKY等家族，另外還有bHLH和HD同源域轉(zhuǎn)錄因子家族等。R2R3-MYB成員是植物中數(shù)目最多的一類MYB蛋白，它們以N-端含有MYB結(jié)構(gòu)域?yàn)楣餐卣?，參與次生代謝的調(diào)節(jié)、控制細(xì)胞的分化、應(yīng)答激素刺激和環(huán)境脅迫及抵抗病原菌的侵害。例如從一種蕨類植物Craterostigma plantagineum中分離的Opm5、7、10蛋白，屬于R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子，它們參與植物對(duì)ABA和干旱的響應(yīng)，R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子是植物苯丙烷類次生代謝的主要調(diào)控者，該代謝所生成的許多次生代謝物廣泛參與了植物對(duì)逆境的反應(yīng)[31]。植物抗逆性的分子調(diào)節(jié)機(jī)制涉及脅迫信號(hào)的感受，細(xì)胞內(nèi)第二信使（Ca2+、活性氧類ROS、磷酸甘油、ABA、二酰甘油等）的產(chǎn)生與介導(dǎo)下游的蛋白質(zhì)磷酸化串聯(lián)物（如CDPK、SOS/PKS、MAPK等）的磷酸化反應(yīng)，這些蛋白質(zhì)磷酸化串聯(lián)物對(duì)下游一系列轉(zhuǎn)錄因子（EREBP/AP2、bZIP等）的激活，以及這些轉(zhuǎn)錄因子對(duì)脅迫應(yīng)答靶基因的調(diào)控等多方面，是一項(xiàng)極其復(fù)雜的系統(tǒng)工程。目前對(duì)于陸稻抗逆性的分子機(jī)制還不完全清楚，有待進(jìn)一步的深入研究。

栽培稻作為世界上最重要的糧食作物，養(yǎng)活了世界上超過半數(shù)的人口；同時(shí)栽培稻也是中國(guó)糧食安全和農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要戰(zhàn)略資源。稻瘟病是中國(guó)稻區(qū)和世界其它稻區(qū)最為嚴(yán)重的病害之一，其發(fā)生歷史悠久、分布廣泛、危害嚴(yán)重；流行年份可減產(chǎn)10%～20%，嚴(yán)重時(shí)可減產(chǎn)40%～50%，甚至絕收。預(yù)防稻瘟病的綜合策略有：首先選擇抗稻瘟病較強(qiáng)的品種進(jìn)行種植；其次運(yùn)用水稻品種多樣性防治稻瘟病技術(shù)控制稻瘟病的發(fā)生和流行；最后輔以化學(xué)農(nóng)藥防治措施。由此可以看出，篩選具有較高抗瘟能力的稻種資源是有效防治稻瘟病流行與發(fā)生的重要基礎(chǔ)。由于世界性的水資源短缺，干旱是影響栽培稻生產(chǎn)最主要的障礙之一，提高栽培稻品種的抗旱性和準(zhǔn)確地鑒定品種的抗旱性，成為育種家們關(guān)注的重要課題。單純考慮產(chǎn)量或單一抗性的育種策略，必將導(dǎo)致育成的新品種具有其它某種缺陷，致使后期的推廣應(yīng)用面臨困難。本研究結(jié)果表明，供試陸稻品種在面臨生物與非生物脅迫時(shí)，在抗性表現(xiàn)上具有相似性。這就使得育種過程中培育兼具較好抗瘟、抗旱能力的栽培稻新品種成為可能。在一種抗性的育種過程中，兼顧其它抗性的選育；或是直接培育具有復(fù)合抗性的作物新品種，成為未來新品種選育過程中的新趨勢(shì)。

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責(zé)任編輯：黃東杰