二肽N—甲酰甘氨酰—L—蛋氨酸的合成及表征

楊長安 盧嬰 夏云川

【摘要】本文首先采用甲酸和乙酸酐的混合物對甘氨酸甲?；苽銷-甲酰甘氨酸；然后將L-蛋氨酸和甲醇在氯化亞砜催化作用下制備L-蛋氨酸甲酯鹽酸鹽；最后分別采用DMAP和NMM為催化劑，四氫呋喃作溶劑，DCC為縮合劑，制備N-甲酰甘氨酰-L-蛋氨酸；并采用液相色譜對中間體和目標產(chǎn)物進行了表征。

【關鍵詞】L-蛋氨酸；甘氨酸；二肽；N-甲酰甘氨酰-L-蛋氨酸；DCC縮合

我國飼料市場資源嚴重短缺，市場上僅有的飼料供不應求，而對飼料添加劑的需求也急速擴大[1，2]。蛋氨酸是合成蛋白質(zhì)的一種非常重要的必需氨基酸，它在植物性蛋白中含量較少，主要存在于動物性蛋白中。蛋氨酸在體內(nèi)不能直接合成或轉(zhuǎn)化速度不能滿足動物的正常生理需要，只能靠外源補充來滿足動物對它的需要。甘氨酸作為一種非必需氨基酸，雖然能在動物體內(nèi)合，但一般動物對其的需求量大，單靠自身合成往往不能滿足其正常的生理需求，依靠外界補充甘氨酸對于改善動物飼料營養(yǎng)，促進動物生長發(fā)育具有重要意義[3]。

氨基酸二肽類化合物的合成是近年來一個新的研究熱點[4-6]。由于氨基酸二肽具有特殊的理化性質(zhì)，使其在醫(yī)藥、臨床、化妝品、農(nóng)藥、食品等方面有著非常廣泛的應用。最近研究表明，肽與氨基酸的吸收，存在兩種獨立的轉(zhuǎn)運機制，與氨基酸相比，小肽吸收具有轉(zhuǎn)運快，耗能低、不易飽和等特點，因此肽營養(yǎng)已成為蛋白質(zhì)營養(yǎng)研究的新熱點。從動植物、微生物等中分離出的各種生物活性肽，具有抗氧化、抗生素、激素、激化以及調(diào)節(jié)道味等多種功能，可將其認為是一種新型營養(yǎng)性飼料添加劑。本文首先采用甲酸和乙酸酐的混合物對甘氨酸甲?；苽銷-甲酰甘氨酸；然后將L-蛋氨酸和甲醇在氯化亞砜催化作用下制備L-蛋氨酸甲酯鹽酸鹽；最后分別采用DMAP和NMM為催化劑，四氫呋喃作溶劑，DCC為縮合劑，制備二肽N-甲酰甘氨酰-L-蛋氨酸。通過對反應條件進行優(yōu)化，獲得了合成二肽N-甲酰甘氨酰-L-蛋氨酸的最佳工藝。

1 實驗部分

1.1 主要原料

L-蛋氨酸：分析純，上海源聚生物科技有限公司；甘氨酸：分析純，上海源聚生物科技有限公司；N-甲基嗎啡啉：分析純，中國醫(yī)藥集團上海化學試劑公司；4-氨基苯甲酸乙酯：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；DCC：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；四氫呋喃（THF）（AR）：湖南匯虹試劑有限公司，在氫化鋁鋰中加熱回流12h，干燥情況下蒸餾備用；其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器及測試

Aglient（安捷倫）高效液相色譜儀：色譜柱：C18 250×4.6mm 5μm；流動相：V（0.02M磷酸鹽水溶液）：V（乙腈）= 85：15，柱溫25℃，流速0.8 mL/min，檢測波長220 nm。[7]

1.3 目標產(chǎn)物的合成

首先采用甲酸和乙酸酐的混合物對甘氨酸甲?；苽銷-甲酰甘氨酸；然后將L-蛋氨酸和甲醇在氯化亞砜催化劑作用下制備L-蛋氨酸甲酯鹽酸鹽；最后分別采用DMAP和NMM為催化劑，四氫呋喃作溶劑，DCC為縮合劑，制備N-甲酰甘氨酰-L-蛋氨酸.其合成路線如圖1所示。

1.3.1 N-甲酰甘氨酸的合成

將4.50 g（60 mmol）甘氨酸置于250 mL圓底燒瓶中；加入126 mL甲酸，緩慢升溫使之溶解；在45～50℃恒溫水浴條件下，緩慢恒速滴加醋酸酐42 mL，反應2 h后水浴旋轉(zhuǎn)蒸干溶劑，再加入適量冰水混合，蒸干，冷卻后有白色晶狀固體物質(zhì)析出；最后將產(chǎn)物放在40℃真空干燥箱中，真空干燥。所得固體產(chǎn)物質(zhì)量為5.48 g 。

1.3.2 L-蛋氨酸甲酯鹽酸鹽的合成

在250 mL三口燒瓶中，加入90 mL無水甲醇；置于-5 ℃～-10 ℃環(huán)境下冷卻10 min，恒滴緩慢加入二氯亞砜15 mL；攪拌30 min后，將8.94 g（60 mmol）甘氨酸加入其中；低速攪拌1 h后，緩慢升至室溫，常溫下攪拌24 h以上；減壓旋轉(zhuǎn)蒸干甲醇，得到的產(chǎn)物為白色的粉末狀固體，放在40 ℃的真空干燥箱中干燥24 h，所得固體產(chǎn)物質(zhì)量為10.57 g 。

1.3.3 二肽N-甲酰甘氨酰-L-蛋氨酸的合成

將3.09 g（30 mmol）N-甲酰甘氨酸和3.89 g（31.8 mmol）4-二甲氨基吡啶（DMAP）置于250 mL圓底燒瓶中；加入150 mL無水THF（四氫呋喃），置于-5 ℃～ -10 ℃環(huán)境中；緩慢滴加7.42 g（36 mmol）DCC（二環(huán)己基碳二亞胺）的無水四氫呋喃溶液，反應2 h。另取5.99 g（30 mmol）L-蛋氨酸甲酯鹽酸鹽，置于另一250 mL圓底燒瓶中；向其中加入120 mL四氫呋喃，3.60 g（35.6 mmol）N-甲基嗎啡啉（NMM），攪拌1h。

將上述處理的蛋氨酸甲酯鹽酸鹽轉(zhuǎn)移到裝有N-甲酰甘氨酸的三口瓶中，混合攪拌10 min后，轉(zhuǎn)移到常溫下攪拌24 h；將反應液過濾，取濾液，蒸干溶劑。加乙酸乙酯300 mL，分別用1.0 mol.L-1的檸檬酸、飽和碳酸鈉水溶液洗滌2次，飽和氯化鈉洗滌1次，蒸干有機相；加入60 mL甲醇和1.0 mol.L-1的氫氧化鈉30.0 mL；反應20分鐘后，利用水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸出甲醇，用乙酸乙酯進行萃取，水層用 2.0 mol.L-1的檸檬酸調(diào)節(jié)pH=2；靜置過夜，過濾，水洗至中性，40 ℃下真空干燥，得白色晶狀固體物質(zhì)11.27 g。

2 結(jié)果與討論

2.1 N-甲酰甘氨酸的合成

取7.51g（0.1 mol）甘氨酸，采用乙酸酐做催化劑，在恒溫水浴（45℃ ～ 50℃）條件下，反應時間均為8h?？刂撇煌募姿嵊昧浚疾旒姿嵊昧繉Ψ磻章实挠绊?，其結(jié)果如下表所示。

由上表可知，N-甲酰甘氨酸的最佳合成條件為：溫度50 ℃，甲酸用量為210 mL，乙酸酐用量為70 mL，得產(chǎn)物收率為79.92%，產(chǎn)物熔點測定值為190 ℃～195 ℃。

2.2 L-蛋氨酸甲酯鹽酸鹽的合成

取L-蛋氨酸0.10 mol，采用氯化亞砜做催化劑，在冰鹽?。?5℃～ 10℃）條件下，與無水甲醇進行酯化反應，無水甲醇同時做反應物以及溶劑，故在保證反應完全的前提下，以節(jié)約成本為最佳選擇。調(diào)節(jié)氯化亞砜的用量，考察氯化亞砜用量對反應收率的影響，其結(jié)果如下表所示。

由上表可知：L-蛋氨酸甲酯鹽酸鹽的最佳合成條件為：溫度-5?～ -10℃，甲醇用量為150 mL，氯化亞砜用量為0.1 mol（甘氨酸用量為0.1 mol），得產(chǎn)物收率為88.32%，產(chǎn)物熔點測定值為：115 ℃～ 118 ℃。

2.3 二肽N-甲酰甘氨酰-L-蛋氨酸的合成

在二肽的合成階段，N-甲酰甘氨酸在4-二甲基氨基吡啶（DMAP）催化條件下活化；L-蛋氨酸甲酯鹽酸鹽在N-甲基嗎啡啉（NMM）催化條件下活化，然后通過DCC縮合反應制備N-甲酰甘氨酰-L-蛋氨酸，其實驗結(jié)果如下表所示：

由上表可知，合成條件：溫度在-5 ℃～ -10 ℃條件下，兩種原料各自活化，并在該低溫條件下混合，然后常溫反應；反應物的配比為：N-甲酰甘氨酸與L-蛋氨酸甲酯鹽酸鹽的摩爾比為1：1，N-甲酰甘氨酸與DMAP的摩爾比為1：1.1，L-蛋氨酸甲酯鹽酸鹽用量與NMM的摩爾比為1：1.2，收率80.26%。

2.4 產(chǎn)物的液相色譜數(shù)據(jù)

液相色譜檢測結(jié)果表明：目標產(chǎn)物N-甲酰甘氨酰-L-蛋氨酸的含量為86.85%。

3 結(jié)論

本文首先采用甲酸和乙酸酐的混合物對甘氨酸甲酰化，制備N-甲酰甘氨酸；然后將L-蛋氨酸和甲醇在氯化亞砜催化作用下制備L-蛋氨酸甲酯鹽酸鹽；最后分別采用DMAP和NMM為催化劑，四氫呋喃作溶劑，DCC為縮合劑，成功合成了二肽N-甲酰甘氨酰-L-蛋氨酸。實驗結(jié)果表明：

（1）N-甲酰甘氨酸的最佳合成條件：溫度50 ℃，甲酸用量為210 mL，乙酸酐用量為70 mL，收率79.92% 。

（2）L-蛋氨酸甲酯鹽酸鹽的最佳合成條件：溫度-5?～ -10℃，甲醇用量為150 mL，氯化亞砜用量為0.1 mol（甘氨酸用量為0.1 mol），收率88.32%。

（3）二肽N-甲酰甘氨酰-L-蛋氨酸的合成條件：溫度在-5 ℃～ -10 ℃條件下，N-甲酰甘氨酸與L-蛋氨酸甲酯鹽酸鹽的摩爾比為1：1，N-甲酰甘氨酸與DMAP的摩爾比為1：1.1，L-蛋氨酸甲酯鹽酸鹽用量與NMM的摩爾比為1：1.2。目標產(chǎn)物N-甲酰甘氨酰-L-蛋氨酸的含量為86.85%，收率80.26%。

參考文獻：

[1]王文風，徐玲.綠色飼料添加劑的研究與應用[J].中國飼料添加劑，2010，14：6-9.

[2]王瑩，萬伶俐.綠色飼料添加劑的研究進展及其應用現(xiàn)狀[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2009，（9）：241-244.

[3]蔣挺大，張春萍著.膠原蛋白[M].北京：化學工業(yè)出版社，2001，135-138.

[4]Armido studer.Amino acids and derivatives as stoichiometric auxiliaries in asymmetric synthesis[J]，Synthesis 1996，（7）：793-815.

[5]閆乾順，張娟.采取二酰氯法合成三肽[J].寧夏醫(yī)學院學報，2001，23：242-244.

[6]廖一靜，楊康輝，王舉濤，張瑞環(huán)，徐文方.N-甲酰-L-甲硫氨酰-L-亮氨酰-L-苯丙氨酸（fMLP）三肽的合成[J].中國藥物化學雜志，2007，17：299-301.

[7]于慧娟.反相離子對液相色譜法分析天冬二肽[J].分析測試學報，2003，22：79-81.