諾如病毒檢測技術(shù)新進展

【中圖分類號】R155 【文獻標(biāo)識碼】A 【文章編號】1004-7484（2014）02-0758-02

諾如病毒（Norovirus NoV）又稱諾瓦克病毒（Norwalk-like viruses），屬杯狀病毒科諾如病毒屬，是引起病毒性胃腸炎的重要病原體[1]。NoV是美國學(xué)者Kapikian于1972年通過免疫電鏡技術(shù)首先在發(fā)生于美國俄亥俄州諾瓦克鎮(zhèn)暴發(fā)腹瀉疫情患者糞便中發(fā)現(xiàn)的病毒顆粒[2]。NoV為單股正鏈RNA病毒，是一組形態(tài)相似、抗原性略有不同的病毒顆粒。由于目前不能進行細胞培養(yǎng)和沒有動物模型不能進行中和試驗，NoV目前無法進行經(jīng)典的血清分型[3-5]。該組病毒極易變異，此后在其他地區(qū)又相繼發(fā)現(xiàn)并命名了多種類似病毒，統(tǒng)稱為諾如病毒。由于NoV遺傳的高度變異，在同一時期和同一社區(qū)內(nèi)可能存在遺傳特性不同的毒株流行。NoV抗體沒有顯著的保護作用，尤其是沒有長期免疫保護作用，極易造成反復(fù)感染[6]。大多數(shù)感染者在1～3天后好轉(zhuǎn)，但小孩、老人和低免疫力低下者可能導(dǎo)致嚴(yán)重脫水[7]。

諾如病毒感染性強，以腸道傳播為主，可通過污染的水源、食物、物品、空氣等傳播，常在社區(qū)、學(xué)校、餐館、醫(yī)院、托兒所、孤老院及軍隊等處引起集體暴發(fā)。1995年，我國報道了首例NoV感染[8]，之后山西、北京、安徽、福州、武漢、廣州等地區(qū)先后發(fā)生多起NoV感染性腹瀉暴發(fā)疫情，在我國5歲以下腹瀉兒童中，NoV檢出率為19%左右[9]。以前由于檢驗技術(shù)的滯后使得許多NoV感染病例無法確診。本文綜述NoV檢測技術(shù)的研究進展，為NoV的防控提供理論支持。

1 電鏡法

電鏡法包括直接電鏡法（EM）、免疫電鏡法（IEM）和固相免疫電鏡法（SPIEM）。EM法觀察的靈敏度較低，要求每毫升糞便樣品中至少有大約106個病毒粒子，因此只能用于患病早期病毒大量排出時采集的樣本檢測。IEM法比EM法的敏感性可提高100倍，主要應(yīng)用患者恢復(fù)期血清捕捉同型抗原，從而增加檢出率。SPIEM法是將特異性抗體直接包被載網(wǎng)，同時加入蛋白A增加抗體與抗原接觸的機會，從而增加檢出的靈敏度。方肇寅[9]等曾用20份便樣上清液滴膜后，2%PTA（pH 6.4）染色直接電鏡觀察在國內(nèi)首先發(fā)現(xiàn)了諾瓦克樣病毒。電鏡法的缺陷在于要求觀察者有豐富的經(jīng)驗，精密的檢測儀器和較大的勞動強度，靈敏度相對較低，檢出陽性率只達10-20%，制約了該方法的在NoV檢測中的應(yīng)用[10]，不適于大規(guī)模流行病學(xué)調(diào)查。

2 免疫法

免疫學(xué)檢測法（EIR）包括放射免疫法（RIA）、生物素-親和素免疫法（Biotin-Avidin Immun-oassy）、酶聯(lián)免疫法（ELISA）和免疫層析技術(shù)。

2.1 RIA法和生物素-親和素免疫法

RIA法的靈敏度比IEM法可提高10～100倍，可以檢測出抗體升高的水平，為流行病學(xué)提供更有參考價值的資料。RIA法的不足之處在于它需要6d，且需要放射性同位素標(biāo)記。為了簡化方法，美國疾病預(yù)防控制中心建立了生物素-親和素免疫法，其靈敏度與RIA法相當(dāng)，目前該方法已成為美國疾病預(yù)防控制中心檢測NoV抗原和抗體的標(biāo)準(zhǔn)實驗方法之一。

2.2 ELISA法

1992年Jiang等重組桿狀病毒表達NoV衣殼蛋白成功后，建立起的NoV酶聯(lián)免疫檢測方法快速、靈敏、經(jīng)濟，其不足之處是免疫反應(yīng)的株型特異性太強，所以應(yīng)用范圍還比較窄。陳冬梅[12]等用日本贈送的NoV檢測試劑盒檢測糞便中NoV，分別用NoV GGⅠ、GGⅡ特異性單克隆抗體包被微孔板中的不同小孔捕獲糞便標(biāo)本中的NoV抗原，然后用過氧化物酶標(biāo)記的抗NoV特異性多克隆抗體檢測，所以不同的小孔可同時分別檢測GGⅠ、GGⅡ型NoV。共檢測167份糞便標(biāo)本，GGⅠ型陽性20份、GGⅡ型陽性19份，GGⅠ型、GGⅡ型同時陽性7份，總陽性率27.5%（46/167）。Moe等開發(fā)一種利用NoV的重組抗原檢測唾液中特異性IgA和IgG抗體的ELSIA方法。對該法的評估表明其靈敏度和特異性分別達到100%和95%，但上述結(jié)果還有待進一步驗證。該方法采樣方便，提供了一種檢測血清抗體之外的新途徑[13]。由于NoV培養(yǎng)還未成功，原來用作試劑的病毒抗原數(shù)量受到限制，現(xiàn)在，用分子生物學(xué)技術(shù)已經(jīng)可以人工重組NoV的衣殼蛋白，從而解決了上述問題。酶聯(lián)免疫法特異性強，靈敏度高，診斷迅速，是目前可廣泛應(yīng)用的檢測方法。

2.3免疫層析技術(shù)

此技術(shù)即免疫膠體金技術(shù)，是把層析技術(shù)和免疫親和作用相結(jié)合的快速檢測NoV的方法，操作簡單快速、可靠而應(yīng)用廣泛。該方法是采用抗NoV抗原的單克隆抗體，制成試紙條進行檢測。Tak-anashia S.等[14]首先于檢測NoV病毒的檢測，并與RT-PCR法進行比較，結(jié)果顯示，它們的一致性為84.1%、靈敏度為69.8%、特異性為93.7%，病毒載量檢測限為106-107拷貝/g糞便。國外已有多種商用試劑盒供應(yīng)，目前國內(nèi)市場上皆為國外產(chǎn)品。

3 分子生物學(xué)檢測方法

雜交技術(shù)和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR），自PCR技術(shù)創(chuàng)建以來在廣大科學(xué)工作者和檢驗人員的努力下，在普通PCR的基礎(chǔ)上改進和派生了許多新技術(shù)和新方法。這些衍生的新PCR技術(shù)的靈敏度和特異性得到進一步的提高，檢測范圍得到進一步擴展，從而在疾病診斷、預(yù)防與控制領(lǐng)域檢驗中得到了更廣泛的應(yīng)用[15]。除了能更準(zhǔn)確、靈敏地檢測標(biāo)本中的NoV，尤其是低濃度的NoV感染外，最大的優(yōu)點在于可以進一步對病毒進行基因型的研究，不會受到獲得分型單克隆抗體的限制，對流行病學(xué)研究具有重要意義。

3.1 常規(guī)RT-PCR技術(shù)

劉翼等[16]針對RNA依賴的RNA聚合酶基因區(qū)采用Koopmans引物JV12Y/JV13I引物JV12Y位于4552 4572bp引物JV13I位于48584878bp擴增目標(biāo)片段長度為327bp建立了RT-PCR技術(shù)。在358份腹瀉患兒糞便中檢出NoV 42份，抽取11份進行測序分析與GenBa-nK進行BLASTN庫比較證明為NoV。

3.2 多重RT-PCR技術(shù)

孫亞萍[17]等應(yīng)用針對病毒殼體區(qū)域設(shè)計的4對引物GⅠ-SKF/GⅠ-SKR、COG2F/G2-SKR、SLV5317/SLV 5749、PreCAP1/82b擴增杯狀病毒、星狀病毒殼體區(qū)域的N/S端對于NoV GGⅠ、GGⅡ、札如病毒、星狀病毒得到的擴增產(chǎn)物分別為330、387、434、719bp分子量差距大可直接通過瓊脂電泳進行鑒定。

3.3 熒光RT-PCR技術(shù)

TaqMan熒光探針為線型寡核苷酸熒光基團位于5′端淬滅基團位于3′端在退火階段探針雜交于DNA模板Taq聚合酶5′-3′核酸外切酶活性將5′端連接的熒光基團從探針上切割下來游離于反應(yīng)體系中從而脫離了3′端淬滅基團的作用而釋放熒光。譚翰清[18]等以高保守區(qū)52915376bp作為靶基因、52915310bp為上游引物、53765354bp為下游引物擴增目標(biāo)片段長度為86bp以53195335bp為探針，建立了NoV GGⅠ型TaqMan-MGB探針。Real-time RT-PCR法與以G1-SKF/G2-SKF為引物的常規(guī)RT-PCR相比靈敏度高100倍。司紅麗[19]等以比較保守的NoV GGⅡ型的RNA依賴的RNA多聚酶區(qū)與衣殼蛋白區(qū)的連接區(qū)域為靶向擴增區(qū)域50065025bp為上游引物、51085 089bp為下游引物擴增目標(biāo)片段長度為103bp以5048 5070bp為探針建立了NoV GGⅡTaqMan Real-time RT-PCR檢測法。所建立的方法在102-109拷貝范圍有極好的線性關(guān)系，檢測體系最低檢出限為102拷貝，而常規(guī)RT-PCR檢測體系最低檢出限為103拷貝。與輪狀病毒、腺病毒、甲肝病毒無交叉反應(yīng)。隨機抽取20個該法陽性樣品將純化PCR產(chǎn)物連接到PMD18-T載體上進行序列測定結(jié)果全部為GGⅡ型NoV。王毅謙20]等就用Allglo探針同時檢測GI和GII型NoV的雙重?zé)晒夥崔D(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）的方法，該方法設(shè)計針對GI和GII型諾如病毒開放閱讀框架ORFl及ORF2為目的基因的引物和Allglo探針，優(yōu)化最佳反應(yīng)條件，以一步法熒光RT-PCR快速檢測反應(yīng)體系對96份臨床糞便標(biāo)本進行檢測，結(jié)果與單重?zé)晒釸T-PCR方法符合率100%，且測序結(jié)果顯示目標(biāo)序列正確。證明Allglo探針法檢測GI和GII型NoV技術(shù)特異性好，靈敏度高，可用于感染性腹瀉暴發(fā)中NoV的快速篩查。還有阮佳、許欣[21]等利用逆轉(zhuǎn)錄PCR-毛細管電泳-激光誘導(dǎo)熒光快速檢測法，根據(jù)NoV核酸保守序列選擇引物，擴增出特異的PCR產(chǎn)物；采用響應(yīng)曲面法進行毛細管電泳條件優(yōu)化，以含有DNA熒光染料SYBR Gold的0.5%甲基纖維素為篩分介質(zhì)，通過激光誘導(dǎo)熒光法檢測諾如病毒的PCR產(chǎn)物。在優(yōu)化的毛細管電泳條件下，9 min內(nèi)可完成NoV PCR產(chǎn)物的檢測。擴增產(chǎn)物測序后，與基因庫中NoV的序列進行同源性比對，一致性達99%。遷移時間的日內(nèi)和日間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.1%～1.3%和1.8%～2.6%，已用于糞便中NoV的快速檢測。

3.4 恒溫核酸擴增技術(shù)

恒溫核酸擴增技術(shù)（NASBA）是直接擴增RNA來檢測NoV，樣品中病原RNA得到指數(shù)級擴增，產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳或斑點印跡雜交鑒定結(jié)果。該方法的靈敏度略低于RT-PCR，操作時間短；假陽性率低。呂虹[22]等以恒溫快速檢測方法進行154例北京地區(qū)病毒性腹瀉患者糞便標(biāo)本NoV的檢測，同時用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）作對照，評價該方法。結(jié)果：在154例病毒性腹瀉的病人標(biāo)本中，采用恒溫快速檢測方法進行NoV檢測，陽性結(jié)果61例，陽性率為39.6%，RT-PCR方法進行檢測，陽性結(jié)果54例，陽性率為35.1%，以RT-PCR為金標(biāo)準(zhǔn)計算，檢測靈敏度90.7%（49/54），特異性88%（88/100）。

3.5 基因芯片技術(shù)

基因芯片技術(shù)是一種大規(guī)模集成的固相雜交技術(shù)，其基本原理是以核酸分子雜交即依據(jù)DNA雙鏈堿基互補配對、變性和復(fù)性的原理，以大量已知序列的寡核苷酸、cDNA或基因片段作為探針，檢測樣品哪些樣序列及其互補，然后經(jīng)過一定的檢測系統(tǒng)對雜交信號進行檢測，可定性或定量檢測，與傳統(tǒng)基因診斷技術(shù)相比，DNA芯片技術(shù)具有微型化、高通量、高度平行性和高速性的特點[23]。陳廣全[24]等將發(fā)表在GeneBank中的NoV、星狀病毒、輪狀病毒、甲肝病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒的全序列和部分序列進行比較找到高度保守的核苷酸序列，以此為依據(jù)設(shè)計引物和探針芯片在4℃條件下保存7-15個月性能穩(wěn)定。該芯片在毛蚶中檢出的GGⅡNoV與RT-PCR結(jié)果相對應(yīng)。史蕾[25]等建立了基于磁珠的可視化基因芯片技術(shù)用于NoV快速檢測，檢測靈敏度為提取NoV GGⅡRNA反轉(zhuǎn)錄后的cDNA50ng 20份臨床樣品與RT-PCR比較均為1份GGⅠ、5份GGⅡ陽性、14份陰性。

4 食物中NoV的檢測

RT-PCR檢測食物中NoV存在樣品病毒量含量低，樣品量大且成分復(fù)雜等問題，因此病毒富集濃縮、樣品處理是檢測的關(guān)鍵，其中有兩個重要方面影響檢測結(jié)果，一是樣品中病毒濃縮后的回收率，二是抽提核酸的完整程度和純度。

4.1 病毒濃縮

病毒濃縮NoV濃縮方法一般分為兩大類，一類為有機絮凝沉淀法，主要使用聚乙二醇（PEG）沉淀，PEG是具有強烈吸水性以及凝聚和沉淀蛋白作用的高分子聚合物，先改變樣品pH值，使毒粒與樣品微粒分開，PEG把病毒沉淀下來，達到濃縮的目的。目前對于固體樣品PEG沉淀法是最有效的濃縮方法。膜過濾法是另一類有效濃縮病毒的方法，通過改變膜的pH值使之與帶有電荷的毒粒結(jié)合捕捉病毒，這種方法通常用在濃縮大體積的黏度小、內(nèi)容顆粒小的液體食品或水中。陸建榮[26]等曾用過這種方法檢測海水、生活污水中的NoV，為瓶裝水和其他飲料濃縮NV提供了參考。

4.2 核酸提取

食品樣品中所含有的脂肪、蛋白質(zhì)、金屬離子等物質(zhì)都是RT-PCR反應(yīng)抑制因子。NoV是單鏈RNA病毒，核酸提取方法的優(yōu)劣取決于兩個方面：核酸的質(zhì)量和去除抑制因子的能力。目前應(yīng)用較成熟廣泛的是胍法RNA提取法，即（異）硫氰酸胍-苯酚-氯仿聯(lián)合裂解抽提法，該方法改進后制成市售的TRIzol、RNAzol、Ultraspec等產(chǎn)品，與石英砂、磁珠等多孔顆粒相結(jié)合，已結(jié)合了poly（dT）或特異探針的磁珠能較高程度的提純mRNA，去除反應(yīng)抑制因子。石英砂或磁珠純化RNA與傳統(tǒng)的有機試劑（異丙醇、乙醇）沉淀RNA相比起來，效果較好，只是成本偏高。廣西鄧麗麗、劉巍[27]等應(yīng)用優(yōu)化甘氨酸緩沖液處理牡蠣勻漿液，當(dāng)PEG沉淀濃度為16%時的NoV RNA富集提取效果病毒最好，提取后采用熒光定量RT-PCR方法對牡蠣樣品中的NoV進行檢測，取得了較好的檢測效果。

5 展望

綜述諾如病毒的檢測方法，從電鏡法、免疫法到目前應(yīng)用最廣的分子生物學(xué)法，各有其優(yōu)缺點。選擇一種適用于自己實驗室的檢測試劑和方法是廣大檢驗工作者面臨的問題，電鏡法設(shè)備昂貴不適用日常檢測之用；ELSIA法簡便快速、靈敏度和特異性較高較適合基層實驗室使用，只是試劑成本較高，免疫層析法操作使用最為便捷，但是靈敏度還沒法與各類檢測法相比，且國內(nèi)還法生產(chǎn)此類產(chǎn)品，使應(yīng)用范圍受到很大限制；條件較好的實驗室傾向使用各類基因檢測法，它具有高檢測效率、高靈敏度和用時短的優(yōu)點，其中Real-time RT-PCR的檢出痕達102，是其他檢測方法無法比較的。只是目前所用的NoV檢測系統(tǒng)和檢測試劑大多是國外品牌，且價格較貴，操作技術(shù)相對復(fù)雜，對檢測環(huán)境、檢測條件及檢測人員的技術(shù)水平的要求較為苛刻，還有食品類樣品中NoV的檢測操作費時繁瑣。因此還有待國內(nèi)相關(guān)科技人員的努力，盡快開發(fā)出高通量、高靈敏度和高特異和使用簡便快速的NoV檢測試劑，為國內(nèi)市場提供價廉質(zhì)優(yōu)的產(chǎn)品，促進NoV檢測的開展，為NoV的防控提供技術(shù)支持。

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作者簡介：

雷務(wù)年（1970-）男，畢業(yè)于廣西醫(yī)科大學(xué)大專，主管技師，研究方向：主要從事病原微生物檢驗。