丙型肝炎病毒特異性細胞毒性T淋巴細胞功能分析

宋鐵英

【摘 要】目的：研究丙型肝炎患者丙型肝炎病毒（HCV）特異性細胞毒性T淋巴細胞（CTL）的功能。方法：將表達丙型肝炎病毒核心蛋白的真核表達質(zhì)粒通過基因轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染HepG2細胞，并通過篩選獲得穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染Hep-Core細胞，使用蛋白質(zhì)印跡法檢測證實有HCV核心蛋白表達；分離患者外周血中的單個核細胞，經(jīng)體外誘導擴增后得到HCV特異性CTL（HCV-CTL），以Hep-Core細胞和HepG2細胞作為靶細胞，運用乳酸脫氫酶釋放法檢測HCV-CTL的活性，用酶聯(lián)免疫吸附法檢測培養(yǎng)上清液中干擾素-γ（IFN-γ）的含量，選擇10例正常人作為對照組。結(jié)果：丙型肝炎組患者HCV-CTL活性為（24.1±4.6）%，正常對照組為（43.2±6.1）%，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。丙型肝炎組患者靶細胞培養(yǎng)上清液中IFN-γ的濃度為（961±239）pg/ml，正常對照組為（3125±676）pg/ml， 兩組比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結(jié)論：慢性丙型肝炎患者HCV-CTL活性降低，CTL的免疫功能低下與病毒水平和基因型有一定關(guān)系。

【關(guān)鍵詞】丙型肝炎病毒；特異性細胞毒性T淋巴細胞；功能

【中圖分類號】R373.2+1 【文獻標識碼】A 【文章編號】1004-7484（2014）02-0763-01

慢性丙型肝炎是一種具有嚴重危害性的傳染性疾病[1]。一些報道表明丙型肝炎患者CTL的免疫功能低下，只能起到抗感染的作用，無法抵抗感染細胞中的病毒，導致病毒一直存在于細胞中，最后可能誘發(fā)肝癌。本文對18例慢性丙型肝炎患者外周血中丙型肝炎病毒CTL的活性進行檢測，研究了丙型肝炎患者丙型肝炎病毒CTL的功能?，F(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

慢性丙型肝炎患者18例，其中男11例，女7例，年齡25-56歲，平均年齡41.32歲。所有患者均符合丙型肝炎相關(guān)診斷標準，排除乙肝和免疫缺陷病感染，且半年內(nèi)沒有接受抗病毒和免疫調(diào)節(jié)治療。使用特異性引物聚合酶鏈式反應法進行丙型肝炎病毒基因型檢測。此外選擇10例正常人作為對照，其中男6例，女4例，年齡19-36歲，對照人員免疫缺陷病毒和肝炎標志物檢測均為陰性，無飲酒和損肝藥物使用史。

1.2 實驗方法

使用PCR-SSP法對患者進行丙型肝炎病毒基因型檢測。將表達丙型肝炎病毒核心蛋白的真核表達質(zhì)粒通過基因轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染HepG2細胞，經(jīng)篩選獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的Hep-Core細胞，經(jīng)過蛋白質(zhì)印跡法檢測證實有HCV核心蛋白表達；分離患者外周血中的單個核細胞，經(jīng)體外誘導擴增獲得HCV特異性CTL（HCV-CTL），以Hep-Core細胞和HepG2細胞作為靶細胞，運用乳酸脫氫酶釋放法檢測HCV-CTL的活性，用酶聯(lián)免疫吸附法檢測培養(yǎng)上清液中干擾素-γ（IFN-γ）的含量，以正常人作為對照組。

1.3 統(tǒng)計學處理

使用采用 SPSS15.0分析軟件包對所得到的數(shù)據(jù)進行分析處理，計量資料采用方差分析和t檢驗，P<0.05，具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染細胞中丙型肝炎病毒核心蛋白的表達

運用蛋白質(zhì)印跡法檢測證實使用HCV-C轉(zhuǎn)染的HepG2細胞中有HCV核心蛋白表達，沒有轉(zhuǎn)染或空白的細胞中無HCV核心蛋白表達。

2.2 HCV-CTL活性檢測

運用乳酸脫氫酶法分析18慢性丙型肝炎患者和10例正常人的HCV-CTL活性。丙型肝炎組患者的HCV-CTL活性為（24.1±4.6）%，正常對照組為（43.2±6.1）%，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

2.3 靶細胞培養(yǎng)上清液中IFN- γ濃度的測定

丙型肝炎組患者靶細胞培養(yǎng)上清液中IFN-γ的濃度為（961±239）pg/ml，正常對照組為（3125±676）pg/ml， 兩組比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

2.4 HCV-CTL活性和獲得SVR的關(guān)系

本研究中另外選取完成常規(guī)抗病毒治療的慢性丙型肝炎患者16例，其中獲得SVR患者9例，無應答患者7例，均經(jīng)過HCV-CTL活性檢測。其中獲得SVR患者的HCV-CTL活性為（41.5±2.6）%，無應答患者為（25.1±3.5）%，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

3 討論

慢性丙型肝炎（CHC）是一種具有嚴重危害性的傳染性疾病，主要通過血液傳播。CHC的發(fā)病機制比較復雜，丙型肝炎病毒（HCV）和人體免疫系統(tǒng)的相互作用決定了該病的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)化。HCV慢性感染可能引發(fā)肝臟慢性炎癥、纖維化等，嚴重者甚至會導致肝癌[2]。丙型肝炎患者CTL免疫功能和肝病的惡化程度有一定的關(guān)系[3]。CTL免疫功能低下包括細胞抗病毒能力下降、刺激后增殖能力下降、IFN-γ分泌減少等。丙型肝炎病毒感染細胞后機體會產(chǎn)生針對HCV的特異性細胞毒性T淋巴細胞（CTL）免疫應答，CTL的數(shù)量和質(zhì)量決定了機體阻止病毒感染惡化和清除病毒感染的效果。如果CTL的免疫應答較強，能夠起到完全清除HCV的作用；如果CTL的免疫應答功能低下，只能起到抗感染的作用，無法抵抗感染細胞中的病毒，導致病毒一直存在于細胞中，最后可能誘發(fā)肝癌。

本次研究發(fā)現(xiàn)，慢性丙型肝炎患者HCV-CTL的活性明顯低于正常人。研究顯示細胞誘導后CTL培養(yǎng)上清液中IFN-γ濃度的濃度較正常人明顯降低，這也說明慢性丙型肝炎患者CTL細胞的分泌能力明顯下降，進一步導致其免疫功能低下。獲得SVR患者的HCV-CTL活性明顯高于無應答組，可見隨著血液中HCV RNA水平的下降，細胞中HCV-CTL的活性顯著提高，提示HCV-CTL活性和HCV RNA復制水平有一定相關(guān)性，CTL細胞的免疫功能和控制丙型肝炎病毒復制和清除的基因組有一定關(guān)系。

綜上所述，本次研究表明慢性丙型肝炎患者HCV-CTL的活性降低，CTL的免疫功能會隨之下降。慢性丙型肝炎患者HCV-CTL活性降低，CTL的免疫功能低下與病毒水平和基因型有一定關(guān)系。

參考文獻：

[1] 竇曉光，丁洋.慢性丙型肝炎抗病毒治療的新策略和新方法[J].中國實用內(nèi)科雜志，2010，08（03）：54-55.

[2] 郭振華，陳青鋒，趙正斌.HCV基因分型與干擾素療效相關(guān)性探討[J].臨床檢驗雜志，2010，13（04）：42-43.

[3] 袁英.慢性丙型肝炎病人唾液及精液中無丙型肝炎病毒RNA[J].國外醫(yī)學.內(nèi)科學分冊，2011，09（07）：71-72.