熒光紅–曙紅Y能量轉(zhuǎn)移熒光猝滅法測定痕量鋅

賀元文 呂昌銀 宋鴻志

【摘 要】目的：建立一種新的能量轉(zhuǎn)移熒光法測定頭發(fā)中痕量鋅。方法：在λex/λem=450nm/553nm，乳化劑OP存在下，熒光紅（FR）-曙紅Y（EY）能夠發(fā)生有效能量轉(zhuǎn)移，使EY熒光強度大大提高；而Zn2+與1-（2-吡啶偶氮）-2萘酚（PAN）形成配合物的吸收光譜與FR-EY能量轉(zhuǎn)移體系的發(fā)射光譜有效重疊，再次發(fā)生能量轉(zhuǎn)移，使FR-EY體系熒光猝滅，從而建立痕量鋅的測定新方法。結(jié)果：在實驗最適條件下，Zn2+濃度5.2～450ng/ml范圍內(nèi)與熒光猝滅程度呈良好的線性關(guān)系（r=0.9993）。方法的檢出限為2.01ng/ml；相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.85%～1.72%（n=11）；樣品加標(biāo)回收率為98.0%～101.5%。結(jié)論：方法簡便、靈敏度高，用于頭發(fā)中痕量鋅的測定，結(jié)果滿意。

【關(guān)鍵詞】鋅；熒光紅；曙紅Y；能量轉(zhuǎn)移；熒光猝滅法

【中圖分類號】R19 【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A 【文章編號】1004-7484（2014）02-0756-02

鋅，對人體而言是一種極為重要的微量元素，有“生命的元素”之稱。缺鋅會影響DNA，RNA及蛋白質(zhì)的合成，造成生長遲緩，智力衰退等。兒童缺鋅會引起厭食癥、侏儒癥等。因此，研究痕量鋅的測定方法在生命科學(xué)和生物醫(yī)學(xué)上具有重要意義。

能量轉(zhuǎn)移熒光分析法具有所需儀器簡單、靈敏度高、樣品量少、分析速度快等優(yōu)點，已經(jīng)成為一種有效的痕量分析技術(shù)[1]。此分析方法應(yīng)經(jīng)應(yīng)用于生物大分子、痕量有機物[2-3]、及無機離子鐵[4]、銅[5]、磷[6]、錳[7]等的定量測定。根據(jù)F?rster能量轉(zhuǎn)移理論，研究了在乳化劑OP存在下，熒光紅（FR）和曙紅Y（EY）之間發(fā)生的能量轉(zhuǎn)移。FR的發(fā)射光譜和EY的吸收光譜基本重疊，F(xiàn)R作為能量給予體將自身能量轉(zhuǎn)移給能量接受體EY，使曙紅Y熒光強度大大增強。而PAN- Zn2+配合物吸收光光譜與FR-EY能量轉(zhuǎn)移體系的發(fā)射光譜有效重疊，再次發(fā)生能量轉(zhuǎn)移，使EY的熒光猝滅，由此建立了雙重能量轉(zhuǎn)移熒光猝滅測定痕量鋅的新方法。方法簡便、靈敏度高，用于頭發(fā)中痕量鋅的測定，結(jié)果滿意。

1 材料與方法

1.1 儀器與主要試劑

F-4500熒光分光光度計（Hitachi）；UV-8500紫外可見分光光度計（上海天美）；PB-20（PB-S）型精密酸度計（Sartorius Co. Ltd）。

鋅標(biāo)準(zhǔn)溶液（1.0μg/ml）：準(zhǔn)確稱取0.4424g ZnSO4·7H2O用水溶解定容到100ml，配制成1.00mg/ml的貯備液，使用時稀釋成標(biāo)準(zhǔn)工作液；熒光紅溶液：5.0×10-5mol/L乙醇溶液；曙紅Y溶液：4.0×10-4mol/L；PAN：300mg/L（用無水乙醇配制）；乳化劑OP溶液：5%（V/V）；NaF溶液：4.0mg/ml。

所用試劑均為分析純，用水為二次蒸餾水。

1.2 實驗方法

于10ml比色管，依次加入FR溶液0.5ml，EY溶液1.0ml，乳化劑OP溶液1.5ml，PAN溶液1.0ml，適量的鋅標(biāo)準(zhǔn)工作液，最后用水稀釋至刻度，搖勻。室溫下（20℃左右）放置10min，在熒光分光光度計上于λex =450nm，λem=553nm處測定溶液的熒光強度F和試劑空白熒光強度F0，計算△F=F0-F。以△F對Zn2+濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 結(jié)果與討論

2.1 熒光紅-曙紅Y的能量轉(zhuǎn)移

根據(jù)F?rster能量轉(zhuǎn)移理論，分子間發(fā)生能量轉(zhuǎn)移的必要條件是給體的發(fā)射光譜與受體的吸收光譜要有足夠的重疊。FR的熒光峰524nm和EY的吸收峰波長520nm能很好重疊[8]，為二者之間發(fā)生能量轉(zhuǎn)移提供了前提條件。由于體系的濃度均在10-4mol/L以下，若在稀溶液中仍能發(fā)生能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，必須縮短分子間距離。加入表面活性劑能夠降低表面張力形成膠束，起到縮短分子間距離的作用。實驗選擇加入表面活性劑OP，用EY吸收微弱的端部波長450nm去激發(fā)FR-EY混合體系，既可以保證FR有較大吸收而EY不會被激發(fā)，使能量轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)移效果較好。由圖1可見，在乳化劑OP存在下，F(xiàn)R和EY的熒光峰波長分別為524nm和553nm。當(dāng)FR和EY同時存在時，EY的最大發(fā)射波長不變，但其熒光強度明顯增大，即FR作為能量給體將自身能量轉(zhuǎn)移給接受體EY，使EY熒光強度大幅度提高。

2.2 光譜特性

按照實驗方法測得FR-EY、FR-EY-PAN、FR-EY-Zn2+混合體系的熒光光譜。結(jié)果表明：在乳化劑OP溶液中，F(xiàn)R-EY能量轉(zhuǎn)移體系的熒光峰為553nm，加入PAN后峰形峰位都沒有改變，只是熒光強度略有降低，實驗中不加入PAN，只加入Zn2+，圖譜基本不變，認(rèn)為FR、EY與Zn2+不發(fā)生反應(yīng)。在λex=450nm處測得FR-EY-PAN-Zn2+體系熒光光譜如圖2所示。圖3為PAN-Zn2+ 配合物的紫外可見吸收光譜。由圖3可見，單獨PAN的吸收峰位于477nm，加入Zn2+后，吸收曲線發(fā)生明顯變化：在PAN最大吸收波長處，吸光度逐漸降低；540～580nm處的吸收增強，在555nm處產(chǎn)生新的吸收峰，而且其吸光度隨Zn2+含量增加呈線性增大，表明二者反應(yīng)形成了配合物。

在乳化劑OP溶液中，PAN-Zn2+ 配合物的吸收峰555nm與FR-EY能量轉(zhuǎn)移體系的熒光峰553nm較大重疊。即PAN-Zn2+ 加入可有效吸收FR-EY能量轉(zhuǎn)移體系的熒光，并使其猝滅。由此可建立FR-EY能量轉(zhuǎn)移熒光猝滅法測定Zn2+的新方法。

2.3 試劑用量的影響

研究了FR、EY、PAN用量對體系熒光猝滅值△F的影響，結(jié)果表明當(dāng)FR和EY的體積比為1﹕2時，體系的△F值達(dá)到最大且穩(wěn)定，本文選用5.0×10-5mol/LFR溶液0.5ml；4.0×10-4mol/LEY溶液1.0ml。

PAN用量太少，配合反應(yīng)不完全；PAN用量過多，PAN本身吸收激發(fā)光使空白熒光值降低，△F值也降低，300mg/L的PAN用量在0.80～1.2ml時，△F值最大，實驗中加入1.0ml。

2.4 介質(zhì)和酸度的影響

本文試驗了醋酸鹽緩沖液、磷酸鹽緩沖液、硼酸緩沖液、Tris-HCl等不同緩沖體系以及pH3.0～11.0范圍內(nèi)的酸度對體系的影響。結(jié)果表明：酸度對體系影響不大，而且與不加入緩沖溶液的體系（接近中性）的△F值相近。實驗中不加緩沖溶液，操作更為簡便。

2.5 表面活性性劑的選擇及用量的影響

本文對表面活性劑CTMAB、CPB、SDBS、SLS、乳化劑OP、Tween20、PVA對體系的敏化作用進(jìn)行比較研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：當(dāng)加入乳化劑OP時，體系熒光曲線發(fā)生明顯變化，F(xiàn)R的熒光峰明顯下降，而EY熒光峰明顯上升，F(xiàn)R和EY之間發(fā)生了有效的能量轉(zhuǎn)移，熒光猝滅反應(yīng)靈敏度最大。OP用量為1.2～1.8ml時，體系△F值基本不變，繼續(xù)增大用量靈敏度逐漸降低。實驗選擇加入1.5ml 5% OP溶液。

2.6 體系的穩(wěn)定性

本文試驗了5～45℃溫度對測定體系△F值的影響，試驗表明：在15～30℃時，△F值達(dá)到最大且波動很小。實驗選擇在室溫（20℃左右）下操作，測定體系10min反應(yīng)完全，90min內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 線性范圍、檢出限與精密度

在選定最佳條件下，按照實驗方繪制工作曲線。結(jié)果表明：Zn2+濃度在5.2～450ng/ml范圍內(nèi)服從比爾定律。線性回歸方程為△F=198.8+4012ρ（μg/ml Zn2+），線性相關(guān)系數(shù)r=0.9993。取21份試劑空白溶液進(jìn)行測定，按3S/K計，本法的檢出限為2.01ng/ml。對Zn2+含量為0.1、0.25和0.40μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行11次平行測定，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.85%～1.72%。

2.8 共存離子的影響

對0.25μg/ml Zn2+的測定相對誤差≤±5%時，共存離子的允許量（以質(zhì)量濃度倍數(shù)計）為：K+、Na+、Cl-、Br-（4000）； 、 、Ac-、I- （2000）；F-、 （1000）；Ba2+、Mg2+、Ca2+、Ce4+（100）；Ag+（40）；Pb2+（10）；Co2+ 、Mn2+（5）Fe3+、 Cu2+、Al3+（2）。在常見共存離子中Fe3+、 Cu2+、Al3+干擾較為嚴(yán)重。選用不同的掩蔽劑進(jìn)行試驗，結(jié)果表明，4.0mg/ml NaF加入1.0ml可掩蔽10倍Fe3+，20倍的Al3+；1.0%的硫代硫酸鈉溶液1.0ml掩蔽銅效果較好，可不經(jīng)分離直接測定發(fā)樣中痕量鋅。

2.9 樣品分析

取適量人發(fā)洗凈后，放入丙酮液浸泡12h，然后沖洗，放入烘烤箱在45℃～50℃烘干，冷卻后稱取0.2000g頭發(fā)在電爐中低溫炭化再放入馬弗爐（780℃）中灰化2h，取出冷卻至室溫，加入2ml HNO3（2mol/L）溶解殘渣，轉(zhuǎn)移于50ml小燒杯中，用水洗滌坩堝數(shù)次，用氨水（2mol/L）調(diào)至中性，最后轉(zhuǎn)移于50ml容量瓶中用去離子水定容。

取2.0ml樣品溶液于10ml比色管中加入1.0ml NaF（4.0mg/ml），1.0ml Na2S2SO3（1.0%），按照實驗方法測定，并做標(biāo)準(zhǔn)加入回收試驗，結(jié)果見表1。

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作者簡介：

賀元文（1980-），女，碩士研究生，主管檢驗師，主要從事臨床檢驗研究。