草魚♀×鳡♂F1代胚胎發(fā)育及胚后發(fā)育研究

余來寧等

摘要 [目的] 為草魚雜交育種提供參考。[方法] 用草魚卵與鳡精子進(jìn)行人工雜交， 觀察和記錄雜交后代胚胎與胚后發(fā)育情況。[結(jié)果]雜交一代的平均受精率、孵化率和成活率分別為（75.8±6.2）%、（41.9±8.2）%和（9.3±3.7）%。在水溫20.1～21.6 ℃下，受精卵經(jīng)34 h 25 min孵化。初孵仔魚全長（5.8±0.12）mm，出膜3～4 d開始攝食輪蟲和藻類。經(jīng)65 d培育發(fā)育成幼魚，鱗片出齊，全長（74.0±2.1）mm。[結(jié)論]草魚♀×鳡♂F1代胚胎發(fā)育介于雙親之間，其形態(tài)與母本草魚相似，生長比草魚快，與父本鳡相近。

關(guān)鍵詞 草魚；鳡；雜交；胚胎發(fā)育；胚后發(fā)育

中圖分類號 S965.112 文獻(xiàn)標(biāo)識碼

A 文章編號 0517-6611（2014）20-06639-07

Research on Embryonic and Postembryonic Development of the Hybrid （Ctenopharyngodon idellus ♀×Elopichthys bambusa ♂）

YU Laining et al （College of Life Sciences， Jianghan University， Wuhan， Hubei 430056）

Abstract [Objective] The purpose was to provide a reference for crossbreeding of grass carp.[Method] We conducted hybridization between Ctenopharyngodon idellus（♀） and Elopichthys bambusa （♂） by artificial methods.The process of embryo and postembryonic development were observed and recorded.[ Result] The fertilization rate， hatching rate and survival rate of the hybrid F1 were（75.8±6.2）% ，（41.9±8.2）% and （9.3±3.7）%， respectively.At the water temperature of 20.1-21.6 ℃，the larvae hatched out on about the 34 h 25min after fertilization.The whole length of newlyhatched larvae of the hybrid F1 was（5.8±0.12）mm.The larvae could feed rotifer and unicellular algae after 3 or 4 days hatching.Postembryonic development of the hybrid at the formation of scales， lasted for 65 days， when the young was （74.0±2.1） mm in whole length.[Conclusion] The embryonic development of hybrid F1 was intermediate to their parents， the form of the hybrid F1 was similar to that of their female line of grass carp and the growth rate of larva was faster than grass carp similar to that of their paternal fish.

Key words Grass carp （Ctenopharyngodon idellus）； Elopichthys bambusa； Hybridization； Embryonic development； Postembryonic development

草魚（Ctenopharyngodon idellus）和鳡（Elopichthys bambusa）均屬于鯉形目、鯉科、雅羅魚亞科，分屬草魚屬和鳡屬。草魚為草食性魚類，肉味鮮、生長快、養(yǎng)殖成本低，是我國重要的淡水養(yǎng)殖的對象，產(chǎn)量在世界淡水養(yǎng)殖種類中居第二位。但是，草魚抗病力差，魚種成活率低，嚴(yán)重影響了養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。為了提高草魚的抗病力，自20世紀(jì)60年代以來，我國科技人員以草魚作為親本開展了大量的人工雜交育種試驗，包括3個屬間雜交和7個亞科間雜交[1]。但未能成功培育出抗病草魚品種。

鳡是典型的兇猛性魚類，以活魚為食，具有生長快、個體大、抗病力強(qiáng)、肉質(zhì)堅實、味道鮮美、營養(yǎng)豐富等優(yōu)點，是具有較高經(jīng)濟(jì)價值的上等食用魚類，在歷史上曾被當(dāng)作“害魚”被清除。目前，由于自然資源急劇下降，天然鳡遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足市場需求，近年來在我國南方許多地區(qū)相繼開展鳡的人工繁殖和養(yǎng)殖，鳡已逐步成為新型的養(yǎng)殖對象。

鳡與草魚的親緣關(guān)系較近，二者許多性狀存在優(yōu)勢互補(bǔ)。因此，采用草魚與鳡雜交是較為理想的組合。1975年，長江水產(chǎn)研究所等開展了草魚×鳡雜交試驗，但未能獲得魚苗[2]，此后未見到草魚和鳡雜交的報道。目前鳡的人工繁殖技術(shù)已經(jīng)取得突破，為開展雜交試驗提供了有利條件。為了探索提高草魚的抗病力，筆者以草魚為母本，以鳡為父本，開展了草魚×鳡雜交試驗（簡稱草鳡雜交，后同），并對雜交后代的胚胎發(fā)育、胚后發(fā)育與成活率以及早期生長進(jìn)行了研究，旨在為進(jìn)一步開展草魚雜交育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 親本來源 雜交試驗在武漢江夏區(qū)魯湖漁場繁殖基地進(jìn)行，雜交親本由武漢市四匯水產(chǎn)科技開發(fā)有限公司提供，草魚為長江捕撈的野生魚培育成的親魚，鳡為從長江或湖泊中捕撈的野生鳡馴養(yǎng)成的親魚，2013年使用的鳡是2007年人工繁殖魚苗培育成的親魚。2010～2013年，共進(jìn)行5次雜交試驗，草魚親魚共31尾（♀15尾、♂16尾，個體體重為7.1～13.3 kg），鳡親魚29尾（♀14尾、♂15尾，個體體重為7.0 ～14.8 kg）。

1.2 催產(chǎn)、雜交及孵化

選擇發(fā)育良好的草魚和鳡2～3組，參照夏小平等[3]的方法對雌雄草魚和鳡進(jìn)行人工催產(chǎn)，根據(jù)水溫和2種魚不同的效應(yīng)期，設(shè)計催產(chǎn)時間，一般草魚提前1～2 h，注射催產(chǎn)劑的草魚和鳡親魚分別放入不同的產(chǎn)卵池中，觀察親魚的發(fā)情情況，沖水控制好2種魚的效應(yīng)時間，使之同步。到達(dá)效應(yīng)時間后，檢查排卵和精液情況，選擇質(zhì)量好的精卵，立即進(jìn)行人工授精。雜交受精卵放入孵化環(huán)道或自制的U型孵化器中進(jìn)行孵化。同時，進(jìn)行草魚和鳡同批卵自交， 放入孵化條件相同的不同孵化器中孵化，作為對照。

1.3 胚胎發(fā)育及胚后發(fā)育觀察

取部分受精卵運(yùn)回實驗室，在自制的多功能玻璃水族箱（110 cm×90 cm×60 cm）中充氣流水孵化，孵化用水由儲水池（120 m3）曝氣自來水供給，每箱放入1 000顆卵，每組設(shè)A、B、C 3個平行。胚胎期每10 min隨機(jī)取樣20粒以上受精卵，置于Leica MZ75解剖鏡下進(jìn)行觀察，記錄水溫和胚胎發(fā)育情況，胚胎發(fā)育階段的劃分參考易伯魯[4-5]的方法，胚胎發(fā)育各時期時間以50%以上個體到達(dá)的時間為準(zhǔn)，使用Canon D550照相機(jī)進(jìn)行顯微拍照。孵出后，每天隨機(jī)取樣10尾，用20 mg/L的MS-222麻醉后，在解剖鏡下進(jìn)行觀察和拍照，對照草魚和鳡苗每5 d取樣1次，并使用目測微尺和游標(biāo)卡尺測量3種魚苗的全長，進(jìn)行生長比較，數(shù)據(jù)取平均值。

1.4 受精率、孵化率和成活率的計算

當(dāng)胚胎發(fā)育至原腸中期和出膜期，隨機(jī)取樣3次測算受精率和孵化率；魚苗開口后統(tǒng)計A、B、C各箱魚苗數(shù)量計算成活率，取平均值。按照以下公式計算受精率、孵化率和成活率：

受精率=（達(dá)原腸中期卵數(shù)/抽樣卵數(shù)）×100%；

孵化率=（出膜魚苗數(shù)/抽樣受精卵數(shù)）×100%；

成活率=（開口魚苗數(shù)/卵總數(shù)）×100%。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 用Excel 2010處理數(shù)據(jù)和作圖。照片通過Photoshop CS5軟件處理制成圖版。

2 結(jié)果與分析

2.1 草鳡雜交的受精率、孵化率和成活率

2010～2013年，共進(jìn)行5次草魚♀×鳡♂雜交試驗。由表1可知，雜交F1代的受精率最高為83.5%，最低為65.6%，平均值為75.8%，與對照組草魚自交差異不顯著（P>0.05）；雜交F1代的孵化率最高為52.1%，最低為29.2%，平均值為41.9%，與對照組草魚自交，差異顯著（P<0.05）；雜交F1代的成活率最高為14.6%，最低為4.2%，平均值為9.3%，與對照組草魚自交差異極顯著（P<0.01）。

2.2 草鳡雜交F1及親本的孵化時間

在相同水溫下比較了雜交卵與同批自交草魚和鳡的孵化時間，共進(jìn)行5次試驗。

從表2可以看出，在相同水溫下鳡的發(fā)育速度比草魚快，草鳡雜交卵發(fā)育速度介于雙親之間， 但雜交卵與鳡發(fā)育速度十分接近。t檢驗表明

草鳡雜交卵的孵化時間與草魚存在顯著差異（P<0.05），而與鳡差異不顯著（P>0.05）。

2.3 草鳡雜交F1代的胚胎發(fā)育

草魚卵與鳡精子受精后，吸水膨脹開始發(fā)育，吸水后的雜交卵，呈漂浮狀，無粘性，淡黃色，卵膜直徑為4.6～5.8 mm，卵長（動植物極縱長）1.8～1.9 mm，與草魚卵基本一樣。胚胎發(fā)育外形也與草魚受精卵相似，只是發(fā)育時間較長。在20.1～21.6 ℃水溫下，經(jīng)34 h 25 min孵出，胚胎發(fā)育過程及主要特征見表3和圖1。

2.4 草鳡雜交F1代的胚后發(fā)育

自胚胎孵出后至長齊鱗片幼魚時止，為胚后發(fā)育階段。草鳡雜交F1代胚后發(fā)育歷時65 d，共記錄了16個主要發(fā)育期的形態(tài)和器官分化的特征，具體見表4和圖2。

2.5 草鳡雜交F1代的早期生長

草鳡雜交F1代在仔魚階段生長比雙親快，稚魚階段被鳡超過。在經(jīng)過65 d的培養(yǎng)后，草鳡雜交F1代平均全長達(dá)74 mm，鳡全長達(dá)80 mm， 草魚全長為56.6 mm。草鳡雜交F1代早期生長速度間于雙親之間，比草魚快，存在顯著差異（P<0.05）；與鳡的生長速度相近，無顯著差異（P>0.05）。草鳡雜交F1代與雙親草魚和鳡的早期全長生長記錄見表5。草鳡雜交F1代與雙親的早期生長比較見圖3。

孵出期05.80±0.12卵黃囊呈棒狀后部漸細(xì)，心臟位于卵黃囊前上方，體透明，可見主要血管。眼徑0.38 mm。尾長占全長的24%，與草魚相似。肌節(jié)數(shù)為9+23+13=45。圖2A

胸鰭原基期0.56.50±0.13第2肌節(jié)后下方出現(xiàn)月芽形胸鰭原基，心臟移至卵黃囊前端，居維氏管顯現(xiàn)，尾靜脈寬大。眼下有1個黑點。圖2B

鰓弧期0.77.20±0.14眼后區(qū)出現(xiàn)4個鰓弧，胸鰭增大，血管清晰，眼徑0.4 mm。尾長為全長的27%，肌節(jié)數(shù)為9+23+14=46。圖2C

眼黃色素期17.60±0.15眼出現(xiàn)黃色素，尾靜脈寬呈黃色，口微張動，出現(xiàn)鰓絲芽。肌節(jié)數(shù)為10+22+15=47。圖2D

鰓絲期 1.5 7.80±0.15鰓絲增長，頭抬高伸直，鰓蓋初現(xiàn)。聽囊增大。眼下黑點呈園形，尾靜脈及居維氏管變細(xì)。圖2E

眼黑色素期28.20±0.16眼出現(xiàn)黑色素，眼徑0.42 mm，眼下緣黑點消失。鰓蓋顯現(xiàn)。胸鰭抖動，肩帶出現(xiàn)。卵黃囊漸漸變細(xì)。 圖2F

鰾錐形期38.50±0.17腸管上方出現(xiàn)雛形鰾。卵黃囊更細(xì)長。腸管貫通?？谇耙?，聽囊略大于眼睛。尾長為全長的30%左右。體淡黃色，肌節(jié)數(shù)為11+22+15=48。圖2G

鰾一室期48.70±0.18 腸管內(nèi)出現(xiàn)褶皺，攝食，為混合營養(yǎng)時期?？诙宋?，嗅囊移至吻上部。體青黃色，有黑色素花。圖2H

卵黃吸盡期510.60±0.19卵黃吸盡。腸管褶皺增多，吻端平寬。體側(cè)及頭部背面色素增多；胸鰭基部、尾鰭裙下葉有色素花。

尾椎上翹期712.00±0.19尾椎斜向上翹，脊椎形成。背鰭褶前端形成背鰭原基。尾鰭條12根。肌節(jié)數(shù)為13+20+15=48。圖2I

鰾二室期914.00±0.20圓球形鰾前室出現(xiàn)，后鰾呈錐形。背鰭褶和臀鰭褶上出現(xiàn)鰭條6～7根，尾鰭條16根。肌節(jié)數(shù)為15+18+15=48。圖2J

背鰭形成期1417.10±0.20背鰭與殘留的背鰭褶分離，鰭式3，7。臀鰭增長，尾長為全長的32%，肌節(jié)數(shù)為17+16+15=48。圖2K

臀鰭形成期2020.60±0.30臀鰭形成；鰭式3，8。臀鰭褶消退。尾鰭發(fā)育完整。腹鰭延伸，腹鰭褶收縮圖2L

腹鰭形成期2323.00±0.50腹鰭長成，腹鰭褶僅剩一窄條。胸鰭繼續(xù)發(fā)展，其基部色素花減退，全身布滿色素。圖2M

鱗片出現(xiàn)期4849.00±1.50側(cè)線鱗及其上下鱗片自前向后逐漸長出，腹鰭褶消失，外形間與草魚和鳡之間，偏像草魚。圖2N

幼魚期6574.00±2.10魚體表布滿鱗片，側(cè)線鱗45片，眼較大，外形皆與成魚相同，形態(tài)與草魚相似。圖2O

3 討論

3.1 草魚（♀）×鳡（♂）雜交F1代發(fā)育的特征 由表6可知，草鳡雜交F1代的有些性狀介于雙親之間，如仔魚的肌節(jié)數(shù)、背鰭褶后移肌節(jié)數(shù)、體長/體高及孵化時間、幼魚的鰭式、側(cè)線鱗等。這是因為表型性狀受基因控制，等位基因分別來自雌性和雄性親本，共同影響著性狀變異。有些性狀與母本草魚相接近，如卵裂細(xì)胞的輪廓、桑椹細(xì)胞叢的大小、卵黃囊腹面輪廓、仔魚尾長占全長的比例、咀型等。這可能是因為雜交的卵是由母本所提供的，受母性遺傳影響較大。另外，還有些性狀與父本鳡相接近，如生長速度。

3.2 親緣關(guān)系與雜交成活率的相關(guān)性

草鳡雜交的受精率尚好，與草魚接近，平均值為（75.8±6.2）%，但成活率卻很低僅為（9.3±3.7）%。據(jù)觀察，草鳡雜交卵有3個明顯的死亡階段：①胚孔封閉期：雜交卵受精后能正常發(fā)育，但到胚孔封閉時，很多卵因胚孔不能封閉，而停止發(fā)育。②孵化期：在孵出前后出現(xiàn)大量畸形胚胎，隨后陸續(xù)死亡。③開口前：因孵出的仔魚不開口，不能攝食而大量死亡。魚類遠(yuǎn)緣雜交成活率低是普遍現(xiàn)象。部分已報道的魚類雜交組合成活率情況見表7。

由此可見，雜交組合的成活率與雜交組合的親緣關(guān)系相關(guān)，親緣關(guān)系越遠(yuǎn)，雜交成活率越低，有的甚至得不到成活的后代。這是由于基因、基因表達(dá)與調(diào)控之間存在種的遺傳差異。這種差異愈大，則雜交時的不親和性也愈大[35]，成活率就越低。

3.3 草魚的雜交育種

目前，以草魚為親本的雜交組合初步統(tǒng)計已有10多種，與其雜交的魚類主要包括以下種類，目間有鮻；亞科間有鰱、鳙、鯉、鯽、鯪、團(tuán)頭魴、三角魴、翹嘴鲌、興國紅鯉等，屬間有赤眼鱒、青魚、鳡。草魚雜交雖然已有不少報道，但成功范例并不多，主要是因為親緣關(guān)系太遠(yuǎn)，雜交成活率太低所致。因此，選擇親緣關(guān)系較近的屬間雜交將是今后草魚雜交育種的方向。

草鳡雜交早在40年前曾有人進(jìn)行報道，但沒有獲得成活的雜交魚苗。筆者經(jīng)多次試驗后取得了成功，雖成活率較低，但與以往的屬間雜交情況基本吻合。

通過草鳡雜交早期生長的速度可以看出草鳡雜交生長較快，表現(xiàn)一定的雜交優(yōu)勢。關(guān)于草魚♀×鳡♂雜交后代和抗病性、經(jīng)濟(jì)性狀和遺傳性狀，還需要進(jìn)一步研究。

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