扇貝多肽對(duì)H2O2損傷HaCaT細(xì)胞的保護(hù)作用

黨轉(zhuǎn)寧等

摘要 [目的]建立H2O2誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的體外模型，探討扇貝多肽（PCF）對(duì)H2O2損傷HaCaT細(xì)胞的保護(hù)作用及其作用機(jī)制。

[方法]采用不同濃度的H2O2（50、100、200、300、500 μmol/L）作用HaCaT細(xì)胞12 h后，采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞存活率；用不同濃度（1.42、2.84、5.68 mmol/L）的PCF分別處理細(xì)胞12 h后，加入H2O2（300 μmol/L）繼續(xù)作用12 h，采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力，采用酶生化法法測(cè)定細(xì)胞上清液中LDH活性以及細(xì)胞質(zhì)中GSH-Px、T-AOC和CAT水平。[結(jié)果]與正常組相比，50～500 μmol/L濃度的H2O2依賴性地引起HaCaT細(xì)胞氧化損傷，300 μmol/L 的H2O2使存活率降低到56%（P<0.01）；與模型組相比，不同濃度的PCF均可保護(hù)H2O2誘導(dǎo)的氧化損傷，增加細(xì)胞存活率，降低細(xì)胞LDH的釋放量，提高GSH-Px、T-AOC和CAT含量，增強(qiáng)細(xì)胞抗氧化作用。[結(jié)論]扇貝多肽能對(duì)抗H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激，對(duì)細(xì)胞受損具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與提高抗氧化酶活力有關(guān)。

關(guān)鍵詞 扇貝多肽；H2O2；HaCaT細(xì)胞；氧化應(yīng)激

中圖分類號(hào) S965.3+9 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2014）20-06618-03

Protective Effect of PCF on H2O2induced HaCaT Cell Injury

DANG Zhuanning， HAN Yantao et al

（Medical College of Qingdao University， Qingdao， Shandong 266071）

Abstract [Objective] To establish in vitro model of H2O2induced oxidative stress damage of HaCaT cells， and investigate the polypeptide from Chlamys farreris protective effect and its possible mechanism on H2O2induced damage to HaCaT cells. [Method] Cell Counting Kit8（CCK8） was used to test the cell survival rate of different concentrations （50， 100， 200， 300， 500 μmol/L） H2O2 for 12 h on HaCaT cells； different concentrations （1.42， 2.84， 5.68 mmol/L） PCF treated cell for 12 h， and then the appropriate H2O2 concentration （300 μmol/L） were adopted to treat， CCK8 was used to detect the cell viability. Enzyme biochemical method was applied to detect the activity of LDH in culture supernatants， GSHPx， TAOC and CAT levels in cell lysis solution. [Result] Compared with control group， at 50-500 μmol/L， H2O2 caused concentrationdependent oxidative damage in the HaCaT cell， at 300 μmol/L H2O2 decreased the cell survival rate to 56% （P<0.01）； Compared with model group， all different concentration PCF protected HaCaT cells from oxidative damage induced by H2O2， significantly increased the cell survival rate， decreased the release of LDH and increase GSHPx， TAOC and CAT level， enhanced antioxidation effect of HaCaT cell. [Conclusion] PCF has the significant protective effects on HaCaT cells injured by H2O2， which may be associated with the increased of antioxidase activity.

Key words Polypeptide from Chlamys farreri； H2O2； HaCaT cell； Oxidative stress

人皮膚長(zhǎng)期暴露在外界理化環(huán)境中會(huì)受到各種損害，角質(zhì)形成細(xì)胞（HaCaT細(xì)胞）是構(gòu)成人最外層皮膚的主要細(xì)胞，為機(jī)體和外界提供了一個(gè)天然的屏障。機(jī)體在短期的氧化環(huán)境中暴露，能產(chǎn)生活性氧（ROS），可以依靠自身的抗氧化機(jī)制清除，維持氧化與抗氧的平衡狀態(tài)。研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的紫外線（UV）照射，機(jī)體會(huì)產(chǎn)生過(guò)量的ROS，氧化和損傷細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)、蛋白和DNA，并對(duì)皮膚產(chǎn)生有害影響，包括致癌、炎癥、日光性紅斑和早衰[1-2]。例如，Park等發(fā)現(xiàn)過(guò)量的UVB照射小鼠背部皮膚后引發(fā)小鼠表型的改變[3]。ROS通常包括1O2、O2-·、·OH和H2O2等，有研究表明，在HaCaT細(xì)胞內(nèi)1O2可以氧化損傷細(xì)胞結(jié)構(gòu)，改變線粒體電位和溶酶體穩(wěn)定性[4-5]。筆者通過(guò)使用H2O2這種重要的活性氧為誘導(dǎo)劑，建立H2O2對(duì)HaCaT細(xì)胞氧化損傷的模型，旨在為抗氧化藥物對(duì)UV造成的氧化應(yīng)激損傷提供新的可能的治療。

1 材料與方法

1.1 材料

人角質(zhì)形成細(xì)胞（HaCaT細(xì)胞 ，北京協(xié)和醫(yī)院）；H2O2（Sigma公司）；RPMI-1640培養(yǎng)液、胰蛋白酶、胎牛血清（Hyclone）；CCK-8細(xì)胞增殖-毒性檢測(cè)試劑盒（購(gòu)自日本Dojindo公司）；BCA蛋白定量試劑盒（購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所）；谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）測(cè)試盒、總抗氧化能力（T-AOC）測(cè)定試劑盒、過(guò)氧化氫酶（CAT）測(cè)定試劑盒、乳酸脫氫酶（LDH）測(cè)試盒，購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.2 方法

1.2.1

細(xì)胞培養(yǎng)。

HaCaT細(xì)胞培養(yǎng)于含10%的胎牛血清、1%青鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于含5% CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每24 h換液1次，待細(xì)胞長(zhǎng)到80%～90%時(shí)，吸取瓶中培養(yǎng)液，用PBS沖洗2遍，用濃度0.25%的胰酶和0.02%EDTA消化細(xì)胞，于1 000 r/min離心5 min后棄上清，加入適量培養(yǎng)液吹打成細(xì)胞懸液，1∶2傳代。

1.2.2

H2O2損傷模型的建立。

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞每孔5 000個(gè)接種于96孔培養(yǎng)板，每孔加入100 μl細(xì)胞懸液，分別設(shè)置空白組、正常對(duì)照組、不同濃度H2O2 （50、100、200、300、500 μmol/L）組，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，待細(xì)胞長(zhǎng)至80%時(shí)，用H2O2處理12 h。然后，每孔加入10 μl CCK-8，培養(yǎng)箱中孵育3 h，使用酶標(biāo)儀讀取波長(zhǎng)450 nm處OD值。按照以下公式計(jì)算細(xì)胞存活率：細(xì)胞存活率（%）=（OD試驗(yàn)組-OD空白對(duì)照組）/（OD對(duì)照組-OD空白對(duì)照組）×100%。

1.2.3

藥物對(duì)細(xì)胞存活率的影響。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞每孔5000個(gè)接種于96孔板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至70%～80%時(shí)， 隨機(jī)分為6組：空白組、正常對(duì)照組、模型組和藥物組。正常組正常培養(yǎng)，藥物組先分別加入含終濃度為1.42、2.84和5.68 mmol/L PCF的培養(yǎng)液，37 ℃培養(yǎng)12 h后，棄掉，再向模型組和藥物組內(nèi)分別加入含終濃度為300 μmol/L H2O2的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)12 h后，每組加入10 μl CCK-8，培養(yǎng)箱中孵育3 h，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)細(xì)胞存活率。

1.2.4

細(xì)胞上清液中LDH活力的檢測(cè)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于6孔板中，分別設(shè)立正常對(duì)照組、模型組和不同濃度的藥物組，按照“1.2.3”中方法處理后，收集各組細(xì)胞上清液，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作檢測(cè)LDH活力。每組設(shè)3次重復(fù)。

1.2.5

細(xì)胞中GSHPx、TAOC和CAT水平的檢測(cè)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于6孔板中，分別設(shè)正常對(duì)照組、模型組和不同濃度的藥物組，按“1.2.3”方法處理后，收集各組細(xì)胞，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作檢測(cè)GSH-Px、T-AOC和CAT水平。每組設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.2.6

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析。使用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與分析，結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析或t檢驗(yàn)，各組之間多重比較采用 LSD法。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度H2O2對(duì)HaCaT細(xì)胞存活率的影響

從圖1可以看出，不同濃度（50、100、200、300、500 μmol/L）的H2O2對(duì)HaCaT細(xì)胞的存活有一定的影響。與正常組相比，細(xì)胞存活率情況與H2O2呈現(xiàn)濃度依賴性，表現(xiàn)出氧化損傷趨勢(shì)。當(dāng)H2O2濃度為300 μmol/L時(shí)，細(xì)胞的存活率為正常組的

注：*表示與對(duì)照差異顯著（P<0.05）；**表示與對(duì)照差異極顯著（P<0.01）。

圖1 不同濃度的H2O2對(duì)HaCaT細(xì)胞存活率的影響

56%，差異極顯著（P<0.01）。因此，選擇300 μmol/L的H2O2作用12 h，建立氧化損傷模型。

2.2 不同濃度PCF對(duì)H2O2誘導(dǎo)的 HaCaT細(xì)胞存活率的影響

從圖2可以看出，不同濃度（1.42、2.84、5.68 mmol/L）的PCF對(duì)受損的HaCaT細(xì)胞存活率表現(xiàn)出一定的保護(hù)作用，且隨著PCF濃度的升高，細(xì)胞存活率也呈梯度上升。與模型組相比，1.42、2.84和5.68 mmol/L的PCF將HaCaT細(xì)胞存活率由模型組的55.30%分別提高到60.70%、73.07% 和87.52%，差異顯著（P<0.05）。

注：**表示與對(duì)照差組異極顯著（P<0.01）；△表示與模型組差異顯著（P<0.05）；△△表示與模型組差異極顯著（P<0.01）。

圖2 不同濃度PCF對(duì)H2O2誘導(dǎo)的 HaCaT細(xì)胞存活率的影響

2.3 不同濃度PCF對(duì)H2O2誘導(dǎo)的 HaCaT細(xì)胞LDH釋放量的影響

由表1可知，與對(duì)照組比較，模型組LDH水平顯著升高（P<0.01）；與模型組相比，不同濃度的PCF均可降低LDH釋放量，5.68 mmol/L的PCF可將LDH釋放量降低到37.9%，存在顯著差異（P<0.01）。

2.4 不同濃度PCF對(duì)H2O2誘導(dǎo)的 HaCaT細(xì)胞GSH-Px、T-AOC、CAT和LDH水平的影響

3 討論

筆者通過(guò)不同濃度的H2O2對(duì)HaCaT細(xì)胞進(jìn)行氧化損傷，采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞存活率，因?yàn)镃CK-8內(nèi)水溶性四唑鹽WST-8被細(xì)胞內(nèi)脫氫酶氧化還原后生成橙黃色甲臜染料可溶解在培養(yǎng)液中，生成的甲臜量與活細(xì)胞數(shù)成正比，所以可根據(jù)染料顏色程度反映細(xì)胞的存活狀態(tài)。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)H2O2濃度為300 μmol/L時(shí)，細(xì)胞存活率達(dá)到56%，則選擇H2O2濃度為300 μmol/L，作用12 h為氧化損傷模型。PCF是從櫛孔扇貝中提取，含有8個(gè)氨基酸的水溶性小分子多肽[6-7]。該研究表明 1.42、2.84和5.68 mmol/L的PCF分別將細(xì)胞存活率提高到60.70%、73.07%和87.52%，說(shuō)明PCF對(duì)H2O2誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞氧化應(yīng)激有一定的保護(hù)作用。

LDH是存在于細(xì)胞內(nèi)的一種糖酵解酶，可以間接反映細(xì)胞氧化應(yīng)激受損的程度。當(dāng)細(xì)胞膜受到氧化攻擊可使膜通透性變大或破壞時(shí)，LDH可透過(guò)細(xì)胞膜滲出[8]。筆者通過(guò)收集細(xì)胞上清液，通過(guò)檢測(cè)LDH活力發(fā)現(xiàn)，模型組LDH水平明顯高于正常組，表明HaCaT細(xì)胞在受到H2O2的攻擊后，細(xì)胞膜受損，通透性增大，上清中LDH釋放增多，細(xì)胞活性下降。加入不同濃度的PCF后，LDH釋放減少，表明PCF可對(duì)抗H2O2對(duì)HaCaT細(xì)胞的氧化損傷，保護(hù)細(xì)胞膜的完整性。

H2O2是一種強(qiáng)氧化劑，尤其可以氧化生物膜脂[9]，其作為活性氧家族的重要一員，對(duì)細(xì)胞的氧化應(yīng)激作用已多有報(bào)道。GSH-Px、CAT和T-AOC是細(xì)胞內(nèi)重要的抗氧化防御系統(tǒng)，對(duì)細(xì)胞的氧化具有保護(hù)作用。CAT對(duì)H2O2具有特異性，可將H2O2分解為水和氧，不需要輔助因子即可對(duì)進(jìn)行H2O2清除，并且隨著H2O2濃度的增大，其酶活性也將增大[10]。該研究發(fā)現(xiàn)，300 μmol/L的H2O2可使細(xì)胞氧化受損后，胞內(nèi)CAT水平降低，而加入PCF后各組細(xì)胞內(nèi)PCF水平明顯升高，且與PCF具有濃度依賴性。這表明PCF可提高胞內(nèi)CAT活性，增強(qiáng)細(xì)胞抗氧化能力，對(duì)細(xì)胞氧化應(yīng)激有一定的保護(hù)作用。GSH-Px是機(jī)體內(nèi)重要的氧化防御指標(biāo)之一[11]，可特異地催化還原型GSH對(duì)H2O2的還原反應(yīng)，降低H2O2水平，是一種胞內(nèi)重要的分解H2O2的酶；T-AOC可以反映機(jī)體的總抗氧化能力。該研究結(jié)果表明，與模型組相比，藥物組加入PCF后，胞內(nèi)GSH-Px和T-AOC水平升高，說(shuō)明PCF有提高酶活力的作用。

綜上所述，H2O2能夠成功誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞氧化損傷，而PCF可以降低細(xì)胞上清中LDH含量，增強(qiáng)GSH-Px、T-AOC、和CAT活性，抵抗細(xì)胞脂質(zhì)和蛋白過(guò)氧化，保護(hù)細(xì)胞完整性。該研究為PCF的抗氧化效應(yīng)提供了理論依據(jù)，其機(jī)制可能與提高抗氧化酶活力有關(guān)。

參考文獻(xiàn)

[1]

SIME S， REEVE V E. Protection from inflammation， immunosuppression and carcinogenesis induced by UV radiation in mice by topical Pycnogenol[J]. Photochem Photobiol， 2004， 79（2）：193-198.

[2] KAROL M H. How environmental agents influence the aging process[J]. Biomol Ther（Seoul）， 2009， 17：113-124.

[3] PARK H M， KIM H J， JANG Y P， et al. Direct analysis in real time mass spectrometry （DART-MS） analysis of skin metabolome changes in the ultraviolet B-induced mice[J]. Biomol Ther （Seoul）， 2013， 21（6）：470-475.

[4] SYED FAIZ MUJTABAA， ASHISH DWIVEDIA， NEERA YADAV，et al. Singlet oxygen mediated apoptosis by anthrone involving lysosomes and mitochondria at ambient UV exposure[J]. Journal of Hazardous Materials， 2013，252/253：258-271.

[5] REGENSBURGER J， LEHNER K， MAISCH T， et al. Tattoo inks contain polycyclic aromatic hydrocarbons that additionally generates deleterious singlet oxygen[J]. Exp Dermatol， 2010，19 （8）： 275-281.

[6] LIU X J， Z HANG ZY， LI P， et al. Polypeptide from Chlamys farreri modulates UVB-induced activation of NF-Κb signaling pathway and protection HaCaT cells from apoptosis[J]. Regulatory Peptides， 2009，153（1/3）：49-55.

[7] LI J L， LIU N， CHEN X H， et al. Inhibition of UVA-induced apoptotic signaling pathway by polypeptide from Chlamys farreri in human HaCaT keratinocytes[J]. Radiat Environ Biophys， 2007， 46（3）：263-268.

[8] 張?zhí)m蘭， 曹瓊，張鵬， 等. 槲皮素對(duì)氧化應(yīng)激大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞的保護(hù)作用[J]. 中華神經(jīng)醫(yī)學(xué)雜志， 2009， 8（1）： 10-12.

[9] MATSUMOTO1 K， SUZUKI A， WASHIMI H， et al. Electron paramagnetic resonance decay constant and oxidative stresses in liver microsomes of the selenium-deficient rat[J].J Nutr Biochem，2006， 17（10）：677-681.

[10] SIES H， BCHER T， OSHINO N， et al. Heme occupancy of catalase in hemoglobin-free perfused rat liver and of isolated rat liver catalase[J]. Arch Biochem Biophys， 1973， 54（1）：106-116.

[11] 董衛(wèi)華， 趙長(zhǎng)安， 昝玉璽. 微量元素硒對(duì)寧夏枸杞抗氧化系統(tǒng)的影響[J]. 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)， 2007， 24（4）： 355-357.