魔芋灰霉病病原菌的分子鑒定

劉小芳等

摘要 [目的]對(duì)魔芋灰霉病病原菌進(jìn)行分子鑒定。[方法]通過(guò)提取DNA、 PCR擴(kuò)增、電泳檢測(cè)以及魔芋灰霉病病原菌rDNA的ITS序列分析。[結(jié)果] 采用CTAB法得到的DNA產(chǎn)量較高且純度較好；以其為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，條帶清晰；ITS序列測(cè)序證實(shí)魔芋灰霉病病原菌屬于富氏葡萄孢盤(pán)菌（Botryotinica fuckeliana），Genbank 登陸號(hào)KF802809。[結(jié)論] 該致病菌在魔芋種芋儲(chǔ)藏期間和設(shè)施繁育過(guò)程中危害極為嚴(yán)重，屬首次報(bào)道，為魔芋灰霉病的防治提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞 灰霉病；PCR擴(kuò)增；ITS

中圖分類號(hào) S181.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼

A 文章編號(hào) 0517-6611（2014）20-06560-02

灰霉病是露地、保護(hù)地作物常見(jiàn)且較難防治的一種真菌性病害[1]，它能侵害多種不同的植物，包括蔬菜、中草藥、作物、草坪、果樹(shù)等[2-3]。近年來(lái)，隨著魔芋人工種植面積的不斷擴(kuò)大及種植年限的增加，魔芋灰霉病的發(fā)生及危害性逐年加重，嚴(yán)重影響了魔芋種植業(yè)的發(fā)展和魔芋的產(chǎn)業(yè)化[3]。然而，大多對(duì)灰霉病病原菌的鑒定僅局限在傳統(tǒng)的菌物分類系統(tǒng)上，而傳統(tǒng)的菌物分類是以其形態(tài)特征和生理生化指標(biāo)為分類基礎(chǔ)，大部分菌物的種類多且分布廣，形態(tài)特征也較復(fù)雜，且少數(shù)形態(tài)特征和生理生化指標(biāo)隨著環(huán)境的變化而不穩(wěn)定[3-5]。近年來(lái)，人們利用病原菌核糖體ITS基因區(qū)段的擴(kuò)增對(duì)病原菌進(jìn)行鑒定檢測(cè)及診斷病害的技術(shù)得到了較快的發(fā)展，相比傳統(tǒng)的菌物分類方法，顯示出較大的優(yōu)越性。鑒于此，筆者通過(guò)對(duì)魔芋灰霉病病原菌rDNA的ITS序列分析，從基因水平上確定了引起魔芋灰霉病的病原菌，為今后魔芋的抗病育種和病害防治提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 供試菌株 所用菌株為從染灰霉病的魔芋植株上分離、純化而來(lái)，并經(jīng)致病性鑒定后保存。

1.2 魔芋灰霉病病原菌的DNA提取及檢測(cè)

參照改良CTAB法[5-6] 提取魔芋灰霉病病原菌DNA，總DNA純度及濃度的檢測(cè)用紫外分光光度計(jì)（DU700，Beckman Co.，USA）[7]檢測(cè)：取DNA溶液稀釋一定倍數(shù)，于分光光度計(jì)下測(cè)定A260和A260/A280值；電泳檢測(cè)：1%瓊脂糖120 V電泳50 min，EB染色后，于凝膠成像系統(tǒng)下（Gel Doc X R，BioRad Co.，USA）[7]拍照。

1.3 PCR擴(kuò)增及序列測(cè)定

1.3.1 引物?；颐共〔≡膔DNA的ITS區(qū)域PCR擴(kuò)增選用的通用引物為ITS4和ITS5，其堿基序列：ITS4（5TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC3），ITS5（5GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G3）。

1.3.2 PCR擴(kuò)增。25 μl反應(yīng)體系：10×Buffer（含MgCl2）2.5 μl；2.5 mmol/L dNTP 1 μl；10 mmol/L 引物各0.5 μl；2.5 U/ulTaq酶0.2 μl；ddH2O 19.3 μl，模板2 μl。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性45 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物回收、轉(zhuǎn)化、鏈接和測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果提交Genbank進(jìn)行比對(duì)分析。根據(jù)序列分析的結(jié)果，對(duì)所分離的病原菌進(jìn)行鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 魔芋灰霉病病原菌DNA的質(zhì)量檢測(cè)

改良的CTAB法提取的DNA產(chǎn)率較好，超過(guò)500 mg/g；A260為0.392，A260/A280為1.90，介于理論范圍1.8～2.0，表明該方法提取的DNA產(chǎn)量高且質(zhì)量好。

2.2 魔芋灰霉病病原菌ITS片段PCR擴(kuò)增

以提取的待測(cè)菌株總DNA為模板，以ITS4和ITS5為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，待檢真菌菌株的DNAITS PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳能擴(kuò)增出目的條帶，擴(kuò)增產(chǎn)物大小在 500～600 bp（圖1）。

注：M：Marker；1～10：待測(cè)菌株DNA。

圖1 魔芋灰霉病病原菌PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.3 魔芋灰霉病病原菌ITS序列分析

用通用引物對(duì)魔芋灰霉病病原菌rDNA ITS進(jìn)行擴(kuò)增，能擴(kuò)增出約560 bp的特異性片段，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序后獲得序列（圖2），此序列提交Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行對(duì)比分析，與Botryotinica fuckeliana（富氏葡萄孢盤(pán)菌）相似性達(dá)99%及其以上。因此，可確認(rèn)魔芋灰霉病病原菌屬于富氏葡萄孢盤(pán)菌（Botryotinica fuckeliana），屬首次報(bào)道。

圖2 魔芋灰霉病病原菌（Botryotinica fuckeliana）rDNA 的ITS序列

3 討論

真菌在生長(zhǎng)過(guò)程中其形態(tài)特征受環(huán)境的影響或存在有中間種的情況，這在應(yīng)用形態(tài)學(xué)鑒定時(shí)很不準(zhǔn)確，而利用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)鑒定能直接反映基因本身，具有傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定法無(wú)法比擬的優(yōu)越性。因此，該研究利用ITS序列測(cè)序分析，結(jié)果穩(wěn)定可靠，方便快捷，為魔芋灰霉病的防治提供理論依據(jù)。

應(yīng)用PCR技術(shù)對(duì)魔芋灰霉病進(jìn)行檢測(cè)具有巨大的潛力，但該技術(shù)對(duì)所用引物的設(shè)計(jì)和合成要求較高。該研究中利用通用引物ITS4和ITS5對(duì)病原菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物測(cè)序后提交到Genbank上比對(duì)分析，確定其分類地位。此方法的最大優(yōu)點(diǎn)是適于對(duì)所有真菌的鑒定研究，而不足之處在于必須測(cè)序比對(duì)后才能明確該病原菌的分類地位[8]。該研究已完成魔芋灰霉病病原菌的序列分析，為魔芋灰霉病的防治提供了理論依據(jù)。因此，下一步工作將進(jìn)行魔芋灰霉病病原菌的藥物篩選，防止灰霉病在魔芋種芋儲(chǔ)藏期間和設(shè)施繁育過(guò)程中發(fā)生。

參考文獻(xiàn)

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