微囊化蠟樣芽孢桿菌的噴霧干燥工藝優(yōu)化

黃樂天等

摘要 [目的]提高蠟樣芽孢桿菌在壓力噴霧干燥過程中的存活率，優(yōu)化噴霧干燥工藝。[方法]以微囊化的蠟樣芽孢桿菌為材料，考察進風(fēng)溫度、進料流量、料液比、噴槍孔徑等對噴霧細(xì)胞存活數(shù)的影響。[結(jié)果]當(dāng)進風(fēng)溫度為140 ℃，進料流量為1.5 t/h，料液比為1∶5，噴槍孔徑為2.5 mm時，蠟樣芽孢桿菌的存活率最高，達81% 。[結(jié)論]該研究確定了蠟樣芽孢桿菌的最佳噴霧干燥工藝條件。

關(guān)鍵詞 蠟樣芽孢桿菌； 壓力噴霧干燥；工藝優(yōu)化

中圖分類號 S188；S3 文獻標(biāo)識碼

A 文章編號 0517-6611（2014）20-06546-03

蠟樣芽孢桿菌是土壤中的優(yōu)勢菌，具有作為益生菌的潛在能力，同時也是條件致病菌，能引起食物中毒等[1-3]。我國已對食源性蠟樣芽孢桿菌毒力基因開展了研究[4]，也有學(xué)者構(gòu)建毒力基因缺失的蠟樣菌株[5]。無毒蠟樣芽孢桿菌屬于益生菌，可產(chǎn)生抗菌物質(zhì)[6]，具有超強的生物抑菌效應(yīng)，抑制有害微生物的繁殖，屬新型綠色微生態(tài)胃腸調(diào)節(jié)藥物，且無抗藥性，無毒副作用，可用于禽畜養(yǎng)殖方面。蠟樣芽胞桿菌進入腸道后，消耗腸道內(nèi)的過多氧氣，創(chuàng)造厭氧環(huán)境，促進厭氧菌的生長，調(diào)整腸道菌群失調(diào)，改善微生態(tài)環(huán)境，達到適于有益厭氧菌生存、抑制有害好氧菌的目的。

噴霧干燥是通過機械作用，將需要干燥的物料，分散成很細(xì)的微粒，經(jīng)過霧化后的液滴與熱空氣充分接觸，在瞬間將大部分水分除去，使物料中的固體物質(zhì)干燥成粉末。根據(jù)霧化方式的不同，噴霧干燥可分為離心噴霧干燥法、壓力噴霧干燥法、氣流式噴霧干燥法3種。壓力噴霧干燥是利用高壓泵，在7～25 MPa的高壓條件下將液料送入壓力式霧化器（噴槍）霧化成小液滴，此方法操作簡單，穩(wěn)定，控制方便，容易實現(xiàn)自動化作業(yè)。噴霧干燥法已被用于去除原料中水分，廣泛用于食品、藥品、化工、各種肥料的干燥與造粒。

蠟樣芽孢桿菌噴霧粉最重要的技術(shù)指標(biāo)是其活菌數(shù)，為此，筆者利用壓力噴霧干燥，對經(jīng)微囊化后的無毒蠟樣芽孢桿菌進行干燥處理，并對壓力噴霧干燥中的主要影響因素：進風(fēng)溫度、進料流量、噴槍孔徑、料液比等進行了正交優(yōu)化試驗，確定其最佳噴霧干燥工藝條件。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗菌。蠟樣芽孢桿菌由廣州市微生物研究所實驗室自行分離篩選所得。

1.1.2 培養(yǎng)基。斜面和搖瓶培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基。 種子培養(yǎng)基：蛋白胨 10 g/L，酵母粉5 g/L，葡萄糖10 g/L，NaCl 5 g/L，葡萄糖 20 g/L。發(fā)酵培養(yǎng)基：為廣州市微生物研究所實驗自行設(shè)計。

1.1.3 噴霧輔料（囊材）。

麥芽糊精（DE值為15）、水溶淀粉購自廣州泰昌生物科技有限公司。

1.1.4 主要設(shè)備及儀器。

發(fā)酵罐（規(guī)格為50、500、5 000 L）為廣州市微生物研究所發(fā)酵工程技術(shù)研究中心提供；壓力噴霧干燥機、顯微鏡、電子天平等。

1.2 試驗方法

1.2.1 噴霧料液的準(zhǔn)備。

蠟樣芽孢桿菌發(fā)酵液的制備：從凍干保存管接種到試管斜面，培養(yǎng)溫度為37 ℃，時間為48 h，再將試管斜面挑取少量菌體到三角瓶中，三角搖瓶置于搖床內(nèi)振蕩培養(yǎng)，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)10 h，然后接種到發(fā)酵罐，經(jīng)過50、500、5 000 L逐級擴大培養(yǎng)，發(fā)酵液內(nèi)細(xì)胞形成芽孢并脫落時，停止培養(yǎng)。

噴霧輔料的添加：在上述發(fā)酵液中按各試驗所需的比例添加不等量的輔料（麥芽糊精和淀粉），充分?jǐn)嚢杈鶆?，并溶解完全，作為噴霧干燥試驗用料液。

1.2.2 細(xì)胞計數(shù)。取1 g噴霧粉，用9 ml生理鹽水溶解，常溫下電磁攪拌30 min，然后用生理鹽水經(jīng)一系列的稀釋。取稀釋后的一定量菌液，傾入LB瓊脂板上，37 ℃培養(yǎng)48 h，培養(yǎng)后，記錄平皿上的菌落數(shù)（CFU）。細(xì)胞數(shù)量以cfu/g計。

噴霧粉的存活率按下式表示：

V（%）=N/N0

式中，N0、N分別表示噴霧干燥前后的總活菌數(shù)。

1.2.3 噴霧干燥。

采用壓力噴霧干燥設(shè)備，以下各試驗進風(fēng)流量均保持在40 000 m3/h，空氣壓力為0.5 MPa。噴霧過程料液保持低速攪拌，以保證料液的質(zhì)量均一。

1.2.4 進風(fēng)溫度對細(xì)胞存活率的影響。

采用同一批發(fā)酵液作為噴霧料液，添加輔料使料液比為1∶5，噴嘴孔徑為2.0 mm，進料流量為1.0 t/h，分別將進風(fēng)溫度調(diào)至170、160、150、140、130 ℃，取樣檢測噴霧菌粉的活菌數(shù)，并比較各溫度條件下細(xì)胞的存活率。

1.2.5 進料流量對細(xì)胞存活率的影響。

采用同一批發(fā)酵液作為噴霧料液，添加輔料使料液比為1∶5，噴嘴孔徑為2.0 mm，進風(fēng)溫度為150 ℃，分別將進料流量調(diào)至0.7、0.9、1.1、1.3、1.5 t/h，取樣檢測噴霧菌粉的活菌數(shù)，并比較各流量下細(xì)胞的存活率。

1.2.6 噴槍孔徑對細(xì)胞存活率的影響。采用同一批發(fā)酵液作為噴霧料液，添加輔料使料液比為1∶5，進料流量為1.5 t/h，進風(fēng)溫度為150 ℃，分別使用不同孔徑的噴嘴，規(guī)格分別為1.0、1.5、2.0、2.5 mm，取樣檢測噴霧菌粉的活菌數(shù)，并比較各流量下細(xì)胞的存活率。

1.2.7 料液比對細(xì)胞存活率的影響。

采用同一批發(fā)酵液作為噴霧料液，進料流量為1.5 t/h，噴嘴孔徑為2.0 mm，進風(fēng)溫度為160 ℃，分別將料液比調(diào)至1∶40、1∶20、1∶10、1∶5、1∶4，取樣檢測噴霧菌粉的活菌數(shù)，并比較各流量下細(xì)胞的存活率。

1.2.8 最佳噴霧工藝的確定。通過預(yù)試驗的結(jié)果，確定進風(fēng)溫度、進料流量、噴嘴孔徑、料液比為影響細(xì)胞存活率的因素，采用正交試驗確定蠟樣芽孢桿菌最佳存活率的噴霧條件，采用L9（34）正交試驗，分別以進風(fēng)溫度、進料流量、噴嘴孔徑、料液比作為試驗因素，每個因素設(shè)置3個水平，以確定最佳噴霧工藝。

2 結(jié)果與分析

2.1 進風(fēng)溫度對細(xì)胞存活率的影響

噴霧干燥是將料液霧化成液滴后與熱空氣充分接觸，在瞬間蒸發(fā)掉大部分水分。當(dāng)進料流量一定的條件下，進風(fēng)溫度的高低直接影響到噴塔內(nèi)的溫度和出風(fēng)溫度[7]，設(shè)定進風(fēng)溫度為130、140、150、160、170 ℃時，出風(fēng)溫度相應(yīng)為70、77、83、90、96 ℃。由于干燥時間極短，大量水分蒸發(fā)吸熱使得粉粒溫度在極短時間內(nèi)急劇下降，若進風(fēng)溫度過高，水分蒸發(fā)后粉粒的溫度仍處于高位，不利于細(xì)胞存活，即出風(fēng)溫度過高會對微生物產(chǎn)生長時間熱激反應(yīng)，使得細(xì)胞內(nèi)的高分子物質(zhì)發(fā)生不可逆變性，導(dǎo)致細(xì)胞失活。由圖1可知，進風(fēng)溫度高于150 ℃時，細(xì)胞存活率會顯著下降，細(xì)胞存活率與進風(fēng)溫度成反向關(guān)系。為了保證噴霧效果，出風(fēng)溫度不宜超過80 ℃。

圖1 進風(fēng)溫度對細(xì)胞存活率的影響

2.2 進料流量對細(xì)胞存活率的影響

進料流量增大，單位時間內(nèi)需要蒸發(fā)的水分就會增多，消耗的空氣熱量也會增多，出風(fēng)溫度就降低，細(xì)胞存活率也變高。由圖2可知，進料流量為0.9 t/h時，出風(fēng)溫度為86 ℃，此溫度下細(xì)胞的存活率較低。進料流量越大，細(xì)胞存活率越高，兩者呈正比關(guān)系， 流量從0.7 t/h至1.5 t/h時，細(xì)胞損失數(shù)顯著減少，存活率提高了77%。但進料流量過大也不利，此時存活率沒有得到進一步提升，相反噴霧粉的殘水量增多，貼壁現(xiàn)象嚴(yán)重，使得回收率和保質(zhì)期受到影響，粉塵的流動性差，顆粒粒徑增大。所以應(yīng)綜合考慮選擇適宜的進料流量。

另一方面，當(dāng)霧化器孔徑確定時，進料流量的變化易引起高壓泵壓力的變化。該試驗中，流量為0.7 t/h時料液壓力為9.1 MPa，而流量為1.5 t/h時料液壓力上升到12.7 MPa，特別在噴槍孔徑較小時，此種變化更顯著（數(shù)據(jù)沒有顯示）。微生物細(xì)胞對外界壓力具有一定的耐受范圍，當(dāng)超出其耐受范圍，細(xì)胞膜會破裂，導(dǎo)致其失活。

圖2 進料流量對細(xì)胞存活率的影響

2.3 噴槍孔徑對細(xì)胞存活率的影響

噴槍孔徑越小，霧化效果越好，但噴槍孔徑也直接影響到料液高壓泵的壓力變化，孔徑的微小變化能引起料液壓力的巨大變化，壓力過高會導(dǎo)致細(xì)胞失活，同時增加了設(shè)備的負(fù)擔(dān)。該試驗中，料液流量為1.5 t/h，噴槍孔徑為1.0、1.5、2.0 mm時，料液的壓力分別為33.4、22.5、12.7 MPa，噴槍孔徑與壓力的關(guān)系可以通過物料平衡和伯努利公式推出（沒有顯示）。壓力過高，極易導(dǎo)致細(xì)胞失活，由圖3可知，當(dāng)外界壓力在20 MPa以上時，細(xì)胞的存活率降低。

為了保證噴霧干燥菌粉的細(xì)胞存活率在70%以上，噴槍孔徑適宜在2.0 mm以上。但噴槍孔徑也不能太大，否則霧化效果不好，水分干燥不徹底，噴霧粉殘水量大，粉塵粒徑偏大，易貼壁，影響產(chǎn)品得率。

圖3 噴槍孔徑對細(xì)胞存活率的影響

2.4 料液比對細(xì)胞存活率的影響

噴霧干燥能用于多種微生物或食品的微囊化處理，微囊化既可增強產(chǎn)品的功能效果、提高保質(zhì)期，也可以減少細(xì)胞在噴霧干燥過程中受到高溫的損傷。該試驗采用常用的輔料麥芽糊精和淀粉作為蠟樣芽孢桿菌微囊化的材料。

由圖4可知，當(dāng)囊材數(shù)量偏少時，噴霧干燥的輔料保護作用不明顯，料液比為1∶40時，噴霧效果很差，其中一個原因是輔料沒有起到包埋菌體的作用或包埋效果不好。另外，料液中的固形物濃度高低會影響高壓泵的壓力大小，試驗發(fā)現(xiàn)當(dāng)料液比越高時（其他噴霧條件不變），高壓泵的壓力會相應(yīng)變高，當(dāng)料液比為1∶40、1∶5時，高壓泵的壓力分別為8.3、13.2 MPa。當(dāng)料液比達到一定值時，其對噴霧粉細(xì)細(xì)胞存活率的影響作用不明顯，此時輔料已經(jīng)完全起到包埋效果，不宜再增加輔料量，過高的料液比反而會增加高壓泵的承受負(fù)擔(dān)及細(xì)胞的外受壓力，影響細(xì)胞存活率。

圖4 料液比對細(xì)胞存活率的影響

2.5 蠟樣芽孢桿菌最佳存活率的噴霧工藝優(yōu)化

通過上述預(yù)試驗，選取進風(fēng)溫度（A）、進料流量（B）、料液比（C）、噴槍孔徑（D）作為正交試驗中的4個影響因素，各因素選取3個水平進行L9（34）正交設(shè)計（表1），試驗結(jié)果見表2。

由表2可知，4個因素中料液流量對存活率的影響最大，進風(fēng)溫度次之，噴槍孔徑的影響第3，料液比的影響最小，即B>A>D>C。以細(xì)胞存活率為考察目標(biāo)，最佳噴霧干燥條件為A1B3C3D3，即進風(fēng)溫度140 ℃，進料流量1.5 t/h，料液比為1∶5，噴槍孔徑為2.5 mm。

由于最優(yōu)組合不在正交試驗表中，因此需要進一步驗證優(yōu)化工藝的可靠性。按照最佳噴霧工藝條件進行驗證試驗，噴霧粉的細(xì)胞存活率為81%，高于正交試驗（表2）的結(jié)果，因此選擇的最佳工藝條件可行。

3 結(jié)論與討論

（1）該研究利用麥芽糊精和淀粉對蠟樣芽孢桿菌微囊化處理，然后用壓力噴霧干燥機對其進行干燥。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，噴霧的進風(fēng)溫度、進料流量、料液比、噴槍孔徑等因素對細(xì)胞存活率均有影響，其中進風(fēng)溫度和進料流量對存活率的影響較大，兩者主要是通過影響出風(fēng)溫度進而影響到細(xì)胞的存活情況，當(dāng)出風(fēng)溫度高于80 ℃時，細(xì)胞的存活率明顯降低。料液比的大小影響細(xì)胞的包囊效果，從而影響細(xì)胞的耐溫能力，當(dāng)料液比低于1∶20時，細(xì)胞失活率明顯增大（>50%）。噴槍孔徑能顯著改變高壓泵壓力（即料壓），料壓過大易造成細(xì)胞膜損傷，引起細(xì)胞失活，料壓最好不要高于20 MPa。

（2）通過正交試驗，得到細(xì)胞存活率最佳的噴霧干燥工藝條件為進風(fēng)溫度140 ℃，進料流量1.5 t/h，料液比為1∶5，噴槍孔徑為2.5 mm，此條件下細(xì)胞存活率達81%。

（3）噴霧干燥工藝除考察細(xì)胞存活率指標(biāo)外，噴霧粉的含水量、回收率、物理化學(xué)特性（如粉塵粒徑、流動性、水活性、吸濕性、溶解性、玻璃轉(zhuǎn)化溫度等）等也是影響產(chǎn)品質(zhì)量的重要指標(biāo)[8]，如噴霧粉的水活性會影響其保質(zhì)期，噴嘴孔徑影響粉塵粒徑等，這些問題需要進一步的研究及優(yōu)化。

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責(zé)任編輯 李占東 責(zé)任校對 李巖