細胞分裂素對紅掌愈傷組織不定芽分化與增殖的影響

王晶等

摘要 [目的]研究細胞分裂素對紅掌組培苗繁殖速度及質(zhì)量的影響。[方法] 以繼代培養(yǎng)第6代的愈傷組織為試驗材料，探討了ZT、TDZ、6BA 3種細胞分裂素及其濃度對不定芽分化及變異的影響。[結(jié)果]在使用濃度2.0～8.0 mg/L的范圍內(nèi)，隨著細胞分裂素濃度的增加，正常不定芽的分化數(shù)及葉片數(shù)呈下降趨勢，而異常不定芽分化逐漸增多，且隨著培養(yǎng)時間的延長，這種影響變得更加明顯；3種細胞分裂素的培養(yǎng)效果具有顯著差異，ZT和6BA添加濃度分別在2.0和 4.0 mg/L以下時，其正常不定芽分化較多，不良變異率較少，而TDZ在0.5 mg/L時已顯著抑制了正常不定芽的分化，同時易產(chǎn)生異常不定芽。[結(jié)論]3種細胞分裂素作用的強弱依次為TDZ>ZT>6BA；在紅掌愈傷組織繼代培養(yǎng)誘導(dǎo)不定芽過程中，應(yīng)避免使用高濃度細胞分裂素。

關(guān)鍵詞 紅掌；細胞分裂素；不定芽；分化；變異

中圖分類號 S188 文獻標識碼

A 文章編號 0517-6611（2014）20-06542-04

紅掌（Anthurium andraeaum），又名花燭、安祖花，為天南星科花燭屬多年生常綠草本植物[1]，因其花型奇特、花色艷麗、花期長而備受人們關(guān)注，目前已在國內(nèi)外花卉市場上占據(jù)重要地位。目前紅掌種苗生產(chǎn)已采用大規(guī)模的組培快繁技術(shù)，但與其他無性繁殖方法相比，在組培生產(chǎn)過程中，由于再生途徑的不同而產(chǎn)生不同程度的變異[2]，如果過于追求繁殖速度，也會影響到苗木的品質(zhì)，如出現(xiàn)組培苗玻璃化[3]、脫毒不完全[4]、體細胞無性系變異[5]等現(xiàn)象。研究表明，培養(yǎng)環(huán)境、激素條件、培養(yǎng)代數(shù)都會影響組培苗的變異等品質(zhì)相關(guān)指標，黃小榮等[6]在采用組織培養(yǎng)技術(shù)保存金花茶種質(zhì)資源過程中，前3年未發(fā)現(xiàn)明顯變異現(xiàn)象，之后陸續(xù)出現(xiàn)外植體退化和死亡。而不合理的使用激素往往帶來更為嚴重的后果，高紅兵等[7]研究表明，當培養(yǎng)基中6BA濃度為0.5 mg/L 時，組培苗未出現(xiàn)玻璃化苗；當培養(yǎng)基中6BA濃度為3.0 mg/L時，組培苗玻璃化率高達95%。王玲等[8]研究表明，在一定濃度范圍內(nèi)，添加6BA能夠促進蝴蝶蘭花梗腋芽的增殖，但升高到10.0 mg/L時，個別芽出現(xiàn)變異情況。可見在愈傷組織培養(yǎng)過程中，在不合理的激素條件下，對繁殖系數(shù)與壯苗率等技術(shù)指標產(chǎn)生不良的影響。

激素條件在植物組織培養(yǎng)過程中發(fā)揮著重要作用，為了從質(zhì)量上保證組培苗，筆者研究不同細胞分裂素對紅掌愈傷組織不定芽分化的影響，以期為紅掌組培過程中細胞分裂素的使用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試紅掌品種為紅色系盆栽品種，購自蘇州市花卉市場（編號為YNG01）。選取經(jīng)葉片培養(yǎng)誘導(dǎo)的、繼代培養(yǎng)第6代的愈傷組織，切除已分化出的芽，保留未完全分化的芽點，切成直徑約2 cm的愈傷組織塊為外植體用于試驗。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗設(shè)計。

根據(jù)對前人研究結(jié)果[9]的分析，以1/2MS+NAA 0.1 mg/L為基本培養(yǎng)基，細胞分裂素選用ZT、TDZ、6BA，添加濃度均設(shè)為0.5、2.0、4.0和 8.0 mg/L 4個濃度梯度，添加蔗糖3%、瓊脂粉0.7%，pH為5.8。每組處理12瓶，每瓶接種3個外植體，每組重復(fù)3次。接種后置于培養(yǎng)架上，培養(yǎng)溫度為（25±2）℃，光照時間為12 h/d，光照強度為1 500～2 000 lx，分別在培養(yǎng)30和60 d后進行調(diào)查。

1.2.2 調(diào)查內(nèi)容與方法。30 d后剔除污染瓶數(shù)，取出50%的外植體用于不定芽分化狀況的調(diào)查：①統(tǒng)計正常不定芽的分化數(shù)、葉片生長數(shù)；②觀察不定芽的莖色、葉色以及葉片形態(tài)特征等；③統(tǒng)計異常不定芽數(shù)，其中包括生長點異常：不定芽無生長點；葉形異常：葉片呈勺型、狹長、扭曲等畸形；色素異常：幼葉或幼莖由正常的紅色變?yōu)榫G色（其中全株變綠、生長良好的稱為綠色變異株）。

另50%外植體轉(zhuǎn)入相同培養(yǎng)基中，繼代培養(yǎng)30 d后再次調(diào)查、統(tǒng)計上述性狀。

1.3 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)調(diào)查的不定芽分化數(shù)、葉片數(shù)、各種形態(tài)變異的不定芽數(shù)，利用Excel進行統(tǒng)計與分析，其中變異率 = 各種形態(tài)變異不定芽數(shù) /（正常不定芽數(shù)+異常不定芽數(shù)）×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 細胞分裂素對紅掌愈傷組織不定芽分化及生長的影響

2.1.1 細胞分裂素對紅掌愈傷組織不定芽分化的影響。由圖1～3可知，隨著ZT、TDZ添加濃度的增加，正常不定芽的分化數(shù)呈減少趨勢。繼代培養(yǎng)30 d時，ZT濃度達到8.0 mg/L時，不定芽分化數(shù)下降非常明顯；6BA區(qū)的不定芽分化數(shù)則呈先增加后減少的趨勢，在2.0 mg/L時，不定芽分化數(shù)達到15.75個，高于ZT和TDZ區(qū)，而在8.0 mg/L條件下急劇下降到3.25個，可見在0.5～4.0 mg/L的濃度范圍內(nèi)，6BA對愈傷組織的再分化都有很好的促進作用。與ZT、6BA不同，TDZ區(qū)不定芽分化數(shù)的下降幅度較小，但其不定芽分化數(shù)始終處于較低水平，可能是TDZ有非常強的細胞分裂素活性，這與李浚明[10]的研究結(jié)果一致，認為TDZ的使用濃度比其他細胞分裂素要低得多，通常在0.002～0.200 mg/L。

繼代培養(yǎng)60 d后，3種細胞分裂素的培養(yǎng)效果顯示上述相同的變化趨勢。

2.1.2 細胞分裂素對紅掌愈傷組織不定芽生長的影響。由圖4～6可知，不同細胞分裂素對不定芽葉片生長的影響與不定芽的趨勢較一致，葉片數(shù)隨著ZT、TDZ添加濃度的增加而減少，而6BA則顯示先增加后下降的變化趨勢，在超過4.0 mg/L時會產(chǎn)生抑制作用。綜合來看，在紅掌愈傷組織繼代培養(yǎng)過程中，細胞分裂素ZT在2.0 mg/L以下、6BA在4.0 mg/L以下時，對紅掌愈傷組織不定芽分化及其生長具有促進作用，過高濃度將不利于不定芽的分化與生長。而TDZ的使用濃度應(yīng)更低，該研究中0.5 mg/L時就已抑制了不定芽的分化及生長。

圖4 細胞分裂素ZT對正常不定芽葉片數(shù)的影響

圖5 細胞分裂素TDZ對不定芽葉片數(shù)的影響

圖6 細胞分裂素6BA對不定芽葉片數(shù)的影響

2.2 細胞分裂素對紅掌愈傷組織不定芽形態(tài)變異的影響

供試紅掌品種YNG01的正常試管苗幼莖為紅色；葉片幼嫩時綠中帶紅，成熟后變?yōu)樯罹G。為了分析細胞分裂素對不定芽變異的影響，首先以幼莖及嫩葉作為調(diào)查對象，將莖色和葉色各分為3個等級：不定芽的莖色正常者（紅色）為3級，莖色嵌合、偏紅稍帶綠色者為2級，莖色嵌合、偏綠帶紅色者為1級；葉色正常者（深綠有光澤）為3級，葉片綠色者為2級，葉色黃綠者為1級（圖7）。

圖7 紅掌不定芽莖色、葉色差異與分級

供試品種正常試管苗的葉片為心形，有光澤（圖8a）。但在繼代培養(yǎng)過程中，還觀察到多種類型的異常不定芽，如沒有生長點，雖然著生1～3片葉，但其節(jié)間極短，幾乎無伸長生長（圖8b）。異常不定芽的另一種形態(tài)表現(xiàn)為葉片畸形，如勺型（圖8d，葉片不伸展，呈勺形）、狹長（圖8-e，心形葉較正常細長）、扭曲（圖8f，葉片不伸展，葉緣扭曲）。通過調(diào)查、分析上述異常不定芽的發(fā)生情況，判斷細胞分裂素種類及濃度對紅掌愈傷組織再分化的影響程度。

2.2.1 細胞分裂素對不定芽葉色、莖色的影響。

在紅掌愈傷組織繼代培養(yǎng)誘導(dǎo)分化的不定芽中，不同種類及濃度的細胞分裂素對莖、葉顏色的影響存在顯著差異。由圖9可知，繼代培養(yǎng)30 d后，細胞分裂素添加濃度較高時，紅掌不定芽莖色的紅色變淡、變綠，3種細胞分裂素都表現(xiàn)相同的傾向，ZT濃度從0.5 mg/L上升到8.0 mg/L時，莖色指數(shù)從3.0下降到1.6；6BA濃度從0.5 mg/L上升到8.0 mg/L時，莖色指數(shù)從3.0下降到1.75；在使用細胞分裂素TDZ的情況下，莖色指數(shù)顯著低于ZT與6BA。可見ZT的作用效果略高于6BA，而TDZ的作用最強；繼代培養(yǎng)60 d后，莖色指數(shù)進一步下降。

由圖10可知，細胞分裂素對葉色的影響與莖色基本一致，葉色指數(shù)表現(xiàn)為ZT、6BA >TDZ，且隨使用濃度的增加而下降，繼代培養(yǎng)30 d 與6 0 d之間差異不大?？梢姼邼舛燃毎至阉夭焕诮M培苗的正常生長，甚至引起莖色、葉色的變化，從而降低組培苗的質(zhì)量。因此，在紅掌愈傷組織再分化培養(yǎng)過程中，應(yīng)避免使用活性較強或高濃度的細胞分裂素。

2.2.2 細胞分裂素對不定芽生長點的影響。

3種細胞分裂素的使用濃度設(shè)置為0.5、2.0、4.0和8.0 mg/L，紅掌愈傷組織繼代培養(yǎng)的不定芽分化數(shù)較多，但同時觀察到異常不定芽的發(fā)生率也較高，且隨著使用濃度的增加而呈上升趨勢。由表1可知，繼代培養(yǎng)60 d后，當ZT濃度從0.5 mg/L增加到8.0 mg/L，無生長點的異常不定芽發(fā)生率從0.54%上升到41.97%，TDZ區(qū)由57.14%急劇上升到了84.93%，6BA區(qū)的發(fā)生率也達到43.64%。

2.2.3 細胞分裂素對不定芽葉形變異的影響。

與生長點異常相比，畸形葉的發(fā)生率較低，但隨著3種細胞分裂素濃度的增加，葉形變異率呈上升趨勢。繼代培養(yǎng)60 d后，在ZT、6BA 濃度為8.0 mg/L 時，葉形變異率也分別達到10.47%和18.93%；而TDZ各濃度條件下的畸葉率都較高，可能是激素使用量過高造成的。

2.2.4 細胞分裂素作用與綠色變異株的發(fā)生。

供試品種正常組培苗的莖與嫩葉都呈現(xiàn)紅色，但在繼代培養(yǎng)過程中，從ZT和TDZ低濃度區(qū)、6BA高濃度區(qū)還發(fā)現(xiàn)了一類綠色變異株（圖8c），其全株莖、葉都呈綠色，株型及生長狀態(tài)良好，且在后續(xù)繼代培養(yǎng)過程中能夠穩(wěn)定遺傳，可以認為這是一種體細胞無性系變異，稱其為綠色變異株（表1），這類變異在新品種選育或種質(zhì)資源研究中具有一定的應(yīng)用價值。

3 結(jié)論與討論

在紅掌愈傷組織繼代增殖過程中，適宜的激素條件既有利于愈傷組織的不定芽分化，又會促進不定芽的生長發(fā)育，因此需要掌握細胞分裂素的使用濃度。該研究結(jié)果表明，在紅掌愈傷組織繼代培養(yǎng)過程中，ZT的使用濃度應(yīng)在2.0 mg/L以下，TDZ的使用范圍要低于0.5 mg/L，6BA的使用濃度也要低于4.0 mg/L。若細胞分裂素的濃度過高，則異常不定芽的發(fā)生率就會增加，且隨著培養(yǎng)時間的延長而加劇，使得分化的不定芽大多呈無生長點或畸形葉形態(tài)，這與趙斌等[11]的研究有相同之處，其認為當6BA濃度大于2.0 mg/L時，不定芽分化率雖然有所上升，但分化出的不定芽矮小，且生長緩慢。對于這些異常不定芽，若轉(zhuǎn)入低濃度都適宜繼代培養(yǎng)基后能否恢復(fù)正常形態(tài)還有待進一步研究。

綜合該試驗結(jié)果，可以認為3種細胞分裂素的作用依次為TDZ > ZT > 6BA，這種差異可以體現(xiàn)在不定芽分化數(shù)、莖色、葉色及葉形等方面。如TDZ濃度在0.5 mg/L 時，分化形成的不定芽莖色、葉色已發(fā)生了顯著變化，ZT濃度高于2.0 mg/L 時會產(chǎn)生不良影響，而6BA高于4.0 mg/L 才形成較多的異常不定芽，這與前人的研究結(jié)果[2]，即細胞分裂素的作用為TDZ > ZT > 2ip > 6BA > KT是一致的，而在紅掌組織培養(yǎng)中此前尚少報道。TDZ是一種高效細胞分裂素，在較短時間內(nèi)能有效促進植株再生[12]，因此在紅掌愈傷組織增殖培養(yǎng)中應(yīng)避免使用TDZ與高濃度激素，以利于提高組培苗品質(zhì)。

高濃度的細胞分裂素往往會加劇紅掌異常不定芽的分化，且大多為不良變異，但也獲得了莖、葉發(fā)生綠色變異而生長良好的綠色變異株，由于在后續(xù)繼代培養(yǎng)中能夠穩(wěn)定遺傳，因此是一種體細胞無性系變異。對此前人也有類似的報道，如丁愛萍等[13]在紅掌盆栽品種‘AvoGloria的組培苗中發(fā)現(xiàn)，在MS+2，4D 0.2 mg/L+6BA 8～10 mg/L 的脫分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)后，經(jīng)MS+NAA 0.2 mg/L+6BA 2.0 mg/L 繼代培養(yǎng)時，可產(chǎn)生3%～7%的紅葉變異，可能也是與初代培養(yǎng)時高濃度的激素條件有關(guān)，且經(jīng)過長期繼代培養(yǎng)之后，再生植株中出現(xiàn)變異的可能性更大[14]。因此，對于上述綠色變異株的遺傳穩(wěn)定性還需要進一步觀察、分析。