辣椒SRAP—PCR反應(yīng)體系優(yōu)化及雜交群體多態(tài)性引物篩選

張佳琦　呂慶芳　董黎梨　李映志　葉春海

摘要[目的]對(duì)辣椒SRAP反應(yīng)體系進(jìn)行研究和優(yōu)化，并利用優(yōu)化體系對(duì)164對(duì)多態(tài)性引物進(jìn)行篩選。[方法]采用單因素隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì)和L25（65）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)辣椒SRAP反應(yīng)體系中6種關(guān)鍵因素（退火溫度、Taq DNA聚合酶、Mg2+、dNTPs、引物、模板DNA）進(jìn)行體系優(yōu)化，并以“泡椒”ד青皮大椒”的親本和F1代為材料，利用聚丙烯胺酰胺凝膠進(jìn)行篩選。[結(jié)果]辣椒SRAPPCR的最佳反應(yīng)體系為：退火溫度35.5 ℃，Taq DNA聚合酶1.0 U，模板DNA 2.25 ng/μl，dNTPs 0.2 mmol/L，引物0.4 μmoL/L，Mg2+ 2 mmol/L，總體積為20 μl。利用該體系，從164對(duì)SRAP引物組合中篩選出擴(kuò)增條帶清晰、多態(tài)性豐富、條帶穩(wěn)定的31對(duì)引物組合。[結(jié)論]該體系的建立與多態(tài)性引物組合的篩選為SRAP標(biāo)記技術(shù)在辣椒育種中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞辣椒（Capsicum spp.）；正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)；單因素隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì)；SRAP；PCR

中圖分類號(hào)S641.3文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2014）07-01913-04

辣椒（Capsicum spp.）是一種世界性的蔬菜作物，即可鮮食又可用作辣椒油、辣椒紅素和辣椒素的提煉[1]，同時(shí)含有豐富的VC和礦質(zhì)元素[2]，是我國(guó)人民飲食結(jié)構(gòu)的重要組成部分。隨著SSR（Simple sequence repeat，簡(jiǎn)單序列重復(fù)）、RAPD（Random Amplified polymorphism DNA，隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA）、ISSR（Inter-simple sequence repeat，簡(jiǎn)單序列重復(fù)區(qū)間擴(kuò)增多態(tài)性）、AFLP（Amplified Fragment Length Polymorphism，擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度多態(tài)性）和SRAP（Sequence-Related Amplified Polymorphism，相關(guān)序列多態(tài)性）等DNA分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展，其在辣椒育種中的運(yùn)用日益增多[3-10]。

SRAP標(biāo)記是Li和Quiros開發(fā)的一種基于PCR （ polymerase chain reaction，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）的新型分子標(biāo)記技術(shù)[11]。該標(biāo)記通過獨(dú)特的引物設(shè)計(jì)可對(duì)開放閱讀框 （open reading frames，ORFs）進(jìn)行擴(kuò)增，因個(gè)體間內(nèi)含子、啟動(dòng)子與間隔區(qū)長(zhǎng)度不等而產(chǎn)生多態(tài)性。由于其具有多態(tài)性豐富、成本低廉、操作簡(jiǎn)便、穩(wěn)定性好和高度共顯性等特點(diǎn)[12]，被廣泛用于遺傳多樣性評(píng)價(jià)[13]、種質(zhì)材料鑒定[14]和遺傳圖譜構(gòu)建[15-18]等最早開展SRAPPCR反應(yīng)體系的優(yōu)化研究。隨后，這一分子標(biāo)記技術(shù)被用于辣椒的種子純度檢測(cè)[20-21]、遺傳多樣性分析[22-24]、辣椒雜種優(yōu)勢(shì)的預(yù)測(cè)[25]和自交系遺傳關(guān)系評(píng)價(jià)[26]等方面。

由于SRAP分子標(biāo)記直接擴(kuò)增開放閱讀框，提高了擴(kuò)增結(jié)果與表型性狀的相關(guān)性，可將分子標(biāo)記與基因克隆直接結(jié)合起來[27]，因此而成為遺傳圖譜構(gòu)建的重要分子標(biāo)記之一[28-31]，但在辣椒遺傳圖譜構(gòu)建中的應(yīng)用還比較少。鑒于此，筆者構(gòu)建 “泡椒”ד青皮大椒”的分離群體，通過SRAPPCR擴(kuò)增體系優(yōu)化，利用親本和F1代材料篩選擴(kuò)增多態(tài)性豐富且條帶穩(wěn)定的引物組合，以期為辣椒遺傳圖譜的構(gòu)建奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料 以2013年3月種于廣東雷州的青皮大椒、泡椒及其F1代植株為試驗(yàn)試材。Taq DNA聚合酶和dNTPs，均購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司；1 000 bp DNA Marker，購(gòu)自購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；SRAP引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；PCR儀，購(gòu)自Biometra；凝膠電泳設(shè)備，購(gòu)自北京鴻濤基業(yè)科技發(fā)展有限責(zé)任公司。

1.2基因組DNA的提取與檢測(cè) 采用改良CTAB法[32]提取青皮大椒的總DNA，并采用紫外分光光度計(jì)法檢測(cè)其濃度，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3SRAPPCR單因素隨機(jī)試驗(yàn) 以青皮大椒總DNA為材料，以含Taq DNA聚合酶1 U、Mg2+ 2 mmol/L、模板2.5 ng/μl、dNTPs 0.2 mmol/L、引物0.4 μmol/L的20 μl反應(yīng)體系為基礎(chǔ)，分別改變退火溫度（33、34、35、36和37 ℃）、Taq DNA聚合酶量（0.2、0.5、1.0、1.5和2.0 U）、模板濃度（0.5、1、2、2.5和5 ng/μl）、dNTPs濃度（0.05、0.10、0.20、0.25和0.50 mmol/L）、引物濃度（0.2、0.3、0.4、0.5和0.6 μmol/L）和Mg2+濃度（1.0、1.5、2.0、2.5和3.0 mmol/L），以EM6為正向引物、ME18為反向引物，進(jìn)行5水平單因素隨機(jī)試驗(yàn)，3次重復(fù)。

1.4擴(kuò)增程序 參考Li和Quiros的方法：94 ℃，5 min；94 ℃，1 min，35 ℃，1 min，72 ℃，1 min，5個(gè)循環(huán)；隨后將退火溫度升至50 ℃，其他條件不變，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；最后以72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)6%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳后，銀染檢測(cè)[11]。

1.5SRAPPCR正交試驗(yàn) 以青皮大椒總DNA為模板，采用L25（65）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)（表1）。SRAP正向引物為EM6，反向引物為ME18，總反應(yīng)體系20 μl，基本擴(kuò)增程序按“1.4”中方法；重復(fù)2次。從擴(kuò)增條帶數(shù)、凝膠染色背景和帶的強(qiáng)弱等方面綜合評(píng)價(jià)擴(kuò)增效果[33]，以條帶數(shù)為主，對(duì)所有結(jié)果按照效果好壞排序，取其排序的數(shù)字作為擴(kuò)增效果的評(píng)價(jià)值，評(píng)價(jià)值越高，結(jié)果越好。