木薯MeHDS2基因的克隆與分析

王樹昌等

摘 要 采用RT-PCR技術(shù)，從木薯SC124 cDNA中克隆得到一個具有完整閱讀框的基因，命名為MeHDS2，該基因全長2 529 bp，編碼842個氨基酸。蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果表明，MeHDS2蛋白含有保守的1個HD結(jié)構(gòu)域、1個b-zip結(jié)構(gòu)域、1個START結(jié)構(gòu)域和1個MEKHLA結(jié)構(gòu)域；蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示其具有3個典型的α螺旋結(jié)構(gòu)；亞細(xì)胞定位結(jié)果表明，MeHDS2蛋白在植物細(xì)胞核中特異表達(dá)，因此，推測其為HD-ZIP轉(zhuǎn)錄因子家族中的一員?；虮磉_(dá)分析結(jié)果表明，MeHDS2基因在木薯根、莖、葉中都有表達(dá)，但表達(dá)豐度不同。木薯干旱處理14 d后，自形態(tài)學(xué)頂端往下數(shù)第三、四片葉片的MeHDS2表達(dá)量顯著高于根、莖及其他位置葉片組織。本研究為木薯抗旱分子育種提供了理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 木薯；HD結(jié)構(gòu)域；START結(jié)構(gòu)域；表達(dá)載體

中圖分類號 S533 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

Abstract Using RT-PCR technology，one gene sequence named MeHDS2 with 2 529 bp complete opening reading frame（ORF）was obtained from SC124， encoding a protein with 842 amino acids. MeHDS2 had a typical HD-domain，b-zip domain，START domain and a MEKHLA domain. Secondary structure of protein prediction showed that MeHDS2 had three typical α-spiral structures. Subcellular localization results showed that MeHDS2 was specifically expressed in nucleus of plant cells and it should be one member of the HD-Zip family. Gene expression analysis results showed that MeHDS2 was expressed differently in the testing samples，it was predominantly expressed in the 3rd～4th leaves after 14 days of drought treatment. We further speculated that MeHDS2 might have the function as a transcription factor to affect the development of cassava plants. The research provides a theoretical basis for drought resistance molecular breeding.

Key words Cassava；HD-domain；START domain；Expression vector

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.09.011

木薯（Manihot esculenta Crantz）是大戟科植物，原產(chǎn)于南美洲亞馬遜河盆地，為一年生木本灌木，是世界上第五大糧食作物，同時也是非洲部分國家人們生存的主要食物來源[1]。木薯最大的優(yōu)點是不與其他糧食作物爭地，在其他作物無法生長的干旱地區(qū)，木薯卻可以很好的生長，其必然存在一定的有效的耐/抗旱機制，值得深入研究。

抗旱相關(guān)基因的表達(dá)需經(jīng)歷逆境信號的接受、轉(zhuǎn)導(dǎo)、誘導(dǎo)基因的轉(zhuǎn)錄以及功能基因的轉(zhuǎn)錄后幾個不同水平的調(diào)節(jié)。在逆境條件下，逆境相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子能與順式作用元件結(jié)合，從而調(diào)節(jié)功能基因的表達(dá)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，這些轉(zhuǎn)錄因子在轉(zhuǎn)基因植物中的過量表達(dá)會激活許多抗逆功能基因的表達(dá)。HD-ZIP家族是一類植物界獨有的轉(zhuǎn)錄因子，包含單一的homeodomain（HD）[2]與一個由亮氨酸拉鏈形成的二聚體結(jié)構(gòu)（b-zip）[3]。擬南芥中HD-ZIP家族有48個成員[3-4]，廣泛參與植物器官組織的發(fā)育過程、激素作用途徑以及對環(huán)境條件的反應(yīng)過程[5]。根據(jù)HD-ZIP家族成員結(jié)構(gòu)域的保守性、基因結(jié)構(gòu)及獨特的生理功能，HD-ZIP可分為4個亞家族。已有的研究發(fā)現(xiàn)，受環(huán)境因子（干旱、極限溫度、滲透脅迫、光照條件）調(diào)控的主要是HD-ZipⅠ或Ⅱ亞家族成員基因；在應(yīng)對環(huán)境條件變化的非生物脅迫時，它們是作為轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控植物發(fā)育過程[6-8]。其他亞家族成員中，HD-ZipⅢ可能對植物細(xì)胞的分化起調(diào)控作用[9-10]；HD-Zip IV亞家族成員則可能調(diào)控植物表皮細(xì)胞的分化[11]。

為研究HD-Zip家族基因在木薯耐干旱生理過程中所發(fā)揮的作用，本研究根據(jù)木薯干旱轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果（相關(guān)內(nèi)容還未發(fā)表）與木薯基因組數(shù)據(jù)的比對分析，采用RT-PCR技術(shù)，從木薯SC124中克隆得到具有完整閱讀框的基因序列，同時對該基因結(jié)構(gòu)、表達(dá)譜及其蛋白亞細(xì)胞定位進行了分析，旨在為進一步研究木薯抗旱機理奠定分子基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 供試木薯品種為“華南124”（SC124），由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院木薯種質(zhì)資源圃提供；煙草（Nicotiana tabacum L.）由本實驗室保存種植。

1.1.2 菌株與載體 大腸桿菌（Escherichia coli）為DH5α；根癌農(nóng)桿菌為（Agrobactrium tumefaciens）LBA4404；克隆載體pMD18-T購自TAKARA（大連寶生物），pCAMBIA1300：GFP由本試驗室改造保存。

1.1.3 酶與化學(xué)試劑 限制性內(nèi)切酶購自Ferments公司；Taq DNA Polymerase、T4 DNA連接酶、DNA Marker、熒光定量PCR試劑等均購自大連寶生物公司；RNA Purification Reagen、膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒均購自TIANGEN公司；其他生化試劑為分析純級。

1.1.4 引物合成及測序 引物合成及測序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計 通過木薯轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析，獲得具有HD-domain結(jié)構(gòu)的且與干旱脅迫相關(guān)的基因序列；然后將其在木薯基因組數(shù)據(jù)庫（http：//www.phytozome.net/cassava.php）中進行同源比對獲得一個電子克??；根據(jù)獲得的電子克隆序列設(shè)計引物（表1），克隆目標(biāo)基因。

1.2.2 目的基因序列的克隆 采用天根公司的植物RNA提取試劑盒方法提取木薯總RNA，利用天根公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒方法合成cDNA第一鏈。根據(jù)設(shè)計的引物，克隆木薯目標(biāo)片段；采用高保真酶進行PCR擴增，PCR反應(yīng)條件為：98 ℃ 10 s， 55 ℃ 10 s， 72 ℃ 2 min， 35個循環(huán)；72 ℃ 5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠回收后與pMD18-T載體相連，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞。將獲得的白色單菌落提取質(zhì)粒，經(jīng)PCR及酶切鑒定為陽性的克隆，送往生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。

1.2.3 生物信息學(xué)分析 利用在線軟件進行生物信息學(xué)分析：（1）基因結(jié)構(gòu)域分析（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）； （2）預(yù)測MeHDS2分子量及等電點： Compute pl/Mwtool， ExPASy軟件（http：//au.expasy.org/tools/pi_tool.html）； （3）蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)預(yù)測（http：//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/）。

1.2.4 基因表達(dá)模式分析 待木薯生長1個月（株高約1 m）后，進行斷水干旱處理；14 d后，分別提取木薯SC124的根、葉柄、不同位置葉片總RNA，經(jīng)DNaseI消化后，反轉(zhuǎn)錄成第一鏈cDNA；采用qPCR（熒光定量PCR）的方法對MeHDS2基因的表達(dá)譜進行分析。

1.2.5 植物表達(dá)載體構(gòu)建 植物表達(dá)載體的構(gòu)建過程如圖1-A所示。具體過程如下：（1）克隆中間載體pMD18-MeHDS2和植物表達(dá)載體pCAMNBIA1300 ∶ GFP質(zhì)粒各約2 μg，經(jīng)限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和XbaⅠ37 ℃消化3 h后，凝膠回收目的條帶；（2）利用T4 DNA連接酶將MeHDS2目的片段與pCAMNBIA1300：GFP大片段于16 ℃連接過夜，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞；（3）對重組質(zhì)粒進行酶切、PCR鑒定，最終將陽性克隆命名為pCAMBIA1300 ∶ GFP ∶ MeHDS2。

通過酶切連接方法[12]進行RNA干擾載體的構(gòu)建，其過程如圖1-B所示。根據(jù)MeHDS2基因特異區(qū)段設(shè)計正反向引物，經(jīng)PCR擴增得到目標(biāo)片段（測序分析為陽性）；利用正反向引物中單一的酶切位點，將MeHDS2基因正反向的2條互補臂分別與一段內(nèi)含子序列（環(huán)結(jié)構(gòu)）兩端連接，形成“頸環(huán)”結(jié)構(gòu)；然后利用“頸環(huán)”結(jié)構(gòu)兩端的內(nèi)切酶位點，將“頸環(huán)”結(jié)構(gòu)插入表達(dá)載體pCAMBIA1300中，構(gòu)建形成MeHDS2基因的干擾載體。提取質(zhì)粒用于后續(xù)的基因功能分析。

將構(gòu)建好的植物表達(dá)載體通過凍融法（于液氮中放置5 min后，以42 ℃水浴5 min）轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404感受態(tài)細(xì)胞，在含有25 mg/L Rif+、50 mg/L Kan+和25 mg/L Chl+的YEB平板中培養(yǎng)，PCR鑒定為陽性的克?。麨長BA4404/1300 ∶ GFP ∶ MeHDS2），可進行后續(xù)的基因功能驗證實驗。

1.2.6 亞細(xì)胞定位 收集LBA4404/1300 ∶ GFP ∶ MeHDS2（OD600為0.8）菌體，重懸菌液，采用針筒注射的方法，將其注射至煙草葉片背部細(xì)胞，共培養(yǎng)72 h后，采用共聚焦顯微鏡觀察，拍照分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 MeHDS2基因克隆與序列分析

通過木薯轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果與木薯基因組數(shù)據(jù)進行BLAST比對，獲得一個差異表達(dá)基因序列的電子克?。会槍υ撾娮涌寺⌒蛄袃啥嗽O(shè)計特異引物，以SC124 cDNA為模板擴增，獲得一個具有完整開放閱讀框（open reading frame，ORF）的長為2 529 bp的基因序列（圖2）。經(jīng)結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)該基因序列包含1個HD 結(jié)構(gòu)域（含59個氨基酸）、1個START結(jié)構(gòu)域（含205個氨基酸）、1個b-zip結(jié)構(gòu)域（含64個氨基酸）和1個MEKHLA結(jié)構(gòu)域（圖3）。NCBI數(shù)據(jù)庫BLAST結(jié)果表明，該序列與楊樹HD-Zip ClassⅢ蛋白（GeneBank序列號為gb|AAX19050）及棉花HD-Zip ClassⅢ蛋白（Gen Bank序列號為： gb|AAY33856）等具有很高的同源性（>92%）。

MeHDS2基因編碼842個氨基酸，預(yù)測其分子量為91.86 ku，等電點（PI）為5.90；通過對MeHDS2蛋白的空間結(jié)構(gòu)預(yù)測分析，發(fā)現(xiàn)其具有3個螺旋結(jié)構(gòu)（圖4）。

2.2 植株體內(nèi)MeHDS2基因?qū)Ω珊档捻憫?yīng)

選取生長1個月的木薯SC124，進行干旱處理14 d后，提取葉片、葉柄和根的總RNA（圖5-A），反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA，針對基因區(qū)特異性片段設(shè)計引物，采用qPCR分析MeHDS2基因在木薯不同組織中的表達(dá)模式。結(jié)果（圖5-B）顯示，干旱處理14 d的木薯不同組織中，MeHDS2基因的表達(dá)量存在差異，自上而下第三至第四片葉子中，該基因表達(dá)量明顯較其他部位葉片、葉柄及根中的高。

2.3 植物表達(dá)載體構(gòu)建

為了解MeHDS2蛋白的功能，將MeHDS2基因與GFP基因進行融合，構(gòu)建了該基因的過表達(dá)植物載體；同時選取其特異區(qū)段，采用酶切連接方法，構(gòu)建了其RNAi植物表達(dá)載體。PCR及雙酶切鑒定結(jié)果表明目標(biāo)表達(dá)載體構(gòu)建成功（圖6）。

2.4 MeHDS2蛋白的亞細(xì)胞定位

將攜帶有1300 ∶ GFP ∶ MeHDS2表達(dá)框的LBA4404菌株通過注射的方法轉(zhuǎn)化煙草葉片，將培養(yǎng)72 h后的葉片經(jīng)20%甘油處理后進行壓片，置于激光共聚焦顯微鏡下觀察。結(jié)果（圖7）表明，融合了GFP的MeHDS2蛋白在煙草葉片細(xì)胞的核內(nèi)特異表達(dá)，表明MeHDS2蛋白定位于細(xì)胞核內(nèi)。

3 討論與結(jié)論

木薯屬于耐干旱、耐貧瘠的作物，其作用機理尚無明確的報道。對木薯抗旱基因的克隆及抗逆作用機理的研究，無論是對其他物種的遺傳改良還是自身品種改良都有重要作用。本研究從SC124木薯品種中克隆得到一個MeHDS2基因?？臻g結(jié)構(gòu)分析表明：（1）該蛋白具有典型的3個螺旋結(jié)構(gòu)，HD-Zip家族多是這個結(jié)構(gòu)[5]；（2）該基因具有1個保守的HD結(jié)構(gòu)域、1個b-zip結(jié)構(gòu)域、1個START結(jié)構(gòu)域（Steroidogenic acute regulatory protein-related lipid transfer），因此，該基因應(yīng)該屬于HD-Zip家族中的一員；（3）該基因的3′末端具有一個MEKHLA結(jié)構(gòu)，此結(jié)構(gòu)域是HD-ZipⅢ亞家族的一個標(biāo)志，該結(jié)構(gòu)域與PAS結(jié)構(gòu)域具有相似性，廣泛存在于生物界，可能對光、氧具有感知作用[13]。因此，推斷MeHDS2蛋白歸屬于HD-ZipⅢ亞家族。轉(zhuǎn)錄因子是細(xì)胞中重要的調(diào)節(jié)機制[14]，目前得到的HD-Zip家族成員多數(shù)定位于細(xì)胞核中[15]。亞細(xì)胞定位實驗表明MeHDS2蛋白同樣定位于細(xì)胞核中。

已有的研究結(jié)果表明，參與植物抗旱生理過程的HD-Zip家族成員主要屬于Ⅰ亞家族和Ⅱ亞家族[5]。本研究克隆得到的MeHDS2基因?qū)儆贖D-ZipⅢ亞家族成員，其在木薯常規(guī)（對照）與干旱處理組織中差異表達(dá)，說明MeHDS2基因參與木薯耐干旱生理過程。干旱處理條件下，MeHDS2基因在木薯不同組織中的表達(dá)模式存在差異，該基因在植株自上而下第三至第四片功能葉中的表達(dá)量明顯較其他部位葉片、葉柄及根中的要高，此時，植株底部葉片萎蔫或脫落，只有頂部葉片正常伸展并進行光合作用。因此推測，木薯干旱脅迫條件下，MeHDS2基因在維持葉片正常的生理過程（光合作用、維持正常水勢）中起作用。由于頂芽處于分裂旺盛期，尚未發(fā)育成功能葉，所以此時MeHDS2基因的表達(dá)沒有明顯增強。

目的基因的分子生物學(xué)研究需要構(gòu)建含有目的基因的植物表達(dá)載體[16]；同時，為充分研究目標(biāo)基因的功能，在構(gòu)建過量表達(dá)載體的同時也應(yīng)構(gòu)建相應(yīng)的干擾載體。RNA干擾（RNA interference， RNAi）技術(shù)被廣泛應(yīng)用于基因功能的發(fā)掘和基因表達(dá)調(diào)控，是分子生物學(xué)研究中一個重要的、有力的工具。RNAi是生物體內(nèi)由短片段雙鏈RNA分子介導(dǎo)的并特異性降解與之同源的mRNA[17-19]，從而誘發(fā)基因沉默的現(xiàn)象[20-23]。為了能夠更直觀地檢測目標(biāo)基因的表達(dá)情況，筆者將目標(biāo)基因與GFP基因融合，導(dǎo)入表達(dá)載體中，這為研究MeHDS2基因在木薯生長發(fā)育過程中的作用提供了技術(shù)平臺。

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