基于SRAP標(biāo)記的海南鉆喙蘭種質(zhì)資源遺傳多樣性分析

顏平等

摘 要 利用SRAP標(biāo)記技術(shù)分析了來自海南島22個居群地的144份海南鉆喙蘭野生資源的遺傳多樣性。結(jié)果顯示，從100對SRAP引物組合中篩選出24對引物組合，共檢測出390個位點(diǎn)，平均每對引物組合檢測位點(diǎn)為16.2個，其中多態(tài)性位點(diǎn)為299個，占76.9%；利用NTSYS-pc2.10軟件，計算海南鉆喙蘭材料間的相似系數(shù)并采用最大距離法（COMPLETE）進(jìn)行聚類分析，結(jié)果144份材料間的相似系數(shù)范圍為0.508～0.959，平均為0.691，在相似系數(shù)為0.515處可將144份材料分為Ⅰ、Ⅱ 2大組，在相似系數(shù)為0.600處，Ⅰ組可分為3個亞組，Ⅱ組可分為9個亞組，東方市板橋鎮(zhèn)的材料相似系數(shù)最大，樂東縣佳西熱帶雨林保護(hù)區(qū)與采自瓊中縣紅毛鎮(zhèn)的材料間相似系數(shù)最小。聚類結(jié)果出現(xiàn)“大雜居、小聚居”的現(xiàn)象，表明海南鉆喙蘭遺傳距離與地理距離不完全相關(guān)。

關(guān)鍵詞 海南鉆喙蘭；種質(zhì)資源；SRAP標(biāo)記；遺傳多樣性

中圖分類號 S682.31 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

Abstract We conducted the genetic diversity analysis of 144 Rhynchostylis gigantea（Lindley）Ridley wild resources form 22 population inhabitations in Hainan Province， by means of SRAP labeling technique. It showed that 390 loci were tested out by 24 primer combinations， which had been screened out from 100 SRAP primer pairs beforehand. Each primer combination could test out about 16.2 loci. Thereinto， polymorphic sites were 299， accounting for 76.9%. Afterwards， we calculated the similarity factors of these R. gigantean materials by NTSYS-2.10， then used maximum distance method（COMPLETE）to do clustering analysis. The results showed that the similarity factors of the 144 materials ranged from 0.508 to 0.959， while the average level is 0.691. At the same time， the 144 materials could be divided into two groups：GroupⅠand GroupⅡwhen the similarity factor was 0.515. GroupⅠcould be divided into 3 subgroups while GroupⅡcould be divided into 9 subgroups when the similarity factor was 0.600. The materials from Banqiao Town， Dongfang City had the maximum similarity factor while the ones from Jiaxi rain forest conservation area， Ledong County and Hongmao Town， Qiongzhong County had the minimum similarity factors. The clustering results showed that most materials in one population inhabitation clustered together while few materials clustered to the ones from other population habitations， meaningthe genetic of R. gigantean and geographic distance was partially correlative.

Key words Rhynchostylis gigantea（Lindl.）Ridl.； Germplasm resources； SRAP labeling technique； Genetic diversity

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.09.003

海南鉆喙蘭[Rhynchostylis gigantea（Lindley）Ridley]又名安諾蘭、無耳蘭，是蘭科（Orchidaceae）鉆喙蘭屬（Rhynchostylis Blume）多年生草本植物，為典型的熱帶附生蘭。海南鉆喙蘭多生于海拔1 000 m以下疏林中的樹干上，主要分布于緬甸、越南、泰國、馬來西亞等東南亞國家及中國海南[1-2]。海南鉆喙蘭株型緊湊，花繁色艷，芳香怡人，具有很高的觀賞價值和開發(fā)應(yīng)用前景。海南鉆喙蘭盛花期為春節(jié)前后，是極好的新春賀歲花卉。在育種應(yīng)用方面，海南鉆喙蘭具有花朵數(shù)多、香味濃、耐熱性強(qiáng)和易雜交等優(yōu)良性狀，其作為第一代雜交親本，目前在英國皇家園藝協(xié)會登錄的新雜交屬就有34個。目前國內(nèi)對海南鉆喙蘭的研究多集中在組培快繁、觀賞形狀評價、核型分析等方面[3-7]，但在種質(zhì)收集及遺傳多樣性分析方面未見報道。因此，從蘭花資源保護(hù)、育種產(chǎn)業(yè)的發(fā)展及開發(fā)利用角度，對海南鉆喙蘭資源進(jìn)行全面的收集、了解其遺傳多樣性顯得十分重要。

相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性（Sequence-related amplified-polymorphism，SRAP）是一種新型的基于PCR擴(kuò)增的標(biāo)記系統(tǒng)，該標(biāo)記技術(shù)是由美國加州大學(xué)蔬菜作物系Li等[8]于2000年發(fā)明的，標(biāo)記采用長17～18 bp的引物對開放閱讀框（ORFs）進(jìn)行擴(kuò)增，因不同物種的內(nèi)含子、啟動子與間隔長度不等而產(chǎn)生多態(tài)性。該標(biāo)記具有操作技術(shù)簡便快速、多態(tài)性高、結(jié)果穩(wěn)定、再現(xiàn)性高、不需預(yù)知物種的序列信息等優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)用范圍廣。目前該技術(shù)在紅掌[9]、海南野生蘭[10]、大花蕙蘭[11]、龍血樹[12]等研究上均有報道，在植物遺傳多樣性分析[13]、種質(zhì)及品種鑒定[14]、遺傳連鎖圖的構(gòu)建[15]、基因組學(xué)[16]研究等方面亦得到廣泛應(yīng)用。筆者利用SRAP標(biāo)記技術(shù)對144份海南鉆喙蘭材料進(jìn)行遺傳多樣性及聚類分析，旨在為海南鉆喙蘭核心種質(zhì)庫的構(gòu)建及種質(zhì)創(chuàng)新奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

2012年8月至2013年6月在海南全島范圍內(nèi)調(diào)查野生海南鉆喙蘭種質(zhì)資源期間，在海南9個市（縣）共發(fā)現(xiàn)22個野生海南鉆喙蘭居群。144份供試海南鉆喙蘭葉片DNA樣本，來自于這22個野生海南鉆喙蘭居群（表1）。

PCR反應(yīng)試劑全部購自Thermo公司；引物采用Li和Quiros[8]設(shè)計的10條上、下游引物，由上海英俊公司合成，引物序列號見表2。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取及檢測 采用改良CTAB法[17]提取DNA，提取的DNA用Thermo scientific公司的Nandodrop 2000分光光度計測定OD260、OD280，并根據(jù)該值檢測DNA質(zhì)量、計算DNA濃度；同時經(jīng)10 g/L的瓊脂糖膠電泳（110 V穩(wěn)壓，15 min）進(jìn)一步檢驗(yàn)。

1.2.2 SRAP-PCR 擴(kuò)增體系及程序 采用本實(shí)驗(yàn)室優(yōu)化的SRAP-PCR反應(yīng)體系（20 μL）擴(kuò)增，具體為：模板DNA 60 ng，Mg2+濃度為2.0 mmol/L，引物濃度為1.0 umol/L，Taq DNA聚合酶濃度為1.5 U/20 μL，dNTPs濃度為0.20 mmol/L，10×Buffer為2 μL，用ddH2O補(bǔ)足到20 μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min、35 ℃復(fù)性1 min、72 ℃延伸1 min，5個循環(huán)；94 ℃變性1 min、50 ℃復(fù)性1 min、72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

1.2.3 引物篩選 采用不同居群的4份海南鉆喙蘭模板DNA，對正、反向各10條引物100個組合進(jìn)行篩選，選出擴(kuò)增條帶多、多態(tài)性好且清晰的引物組合。

1.2.4 PCR產(chǎn)物檢測 采用北京六一儀器廠生產(chǎn)的DYY-10C型電泳儀，用60 g/L聚丙烯酰胺變性膠電泳分離PCR產(chǎn)物。電泳緩沖液為0.5×TBE，1 600 V、70 W電泳4 h，2 g/L AgNO3銀染10～15 min，NaOH顯影，晾干，統(tǒng)計條帶。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

擴(kuò)增產(chǎn)物中只統(tǒng)計清晰、再現(xiàn)性強(qiáng)的條帶，多態(tài)性條帶按有帶記為1、無帶記為0 進(jìn)行統(tǒng)計，生成“0”和“1”組成的原始矩陣。數(shù)據(jù)采用NTSYS-pc2.10軟件中similarity程序計算相似系數(shù)，以clustering程序中SHAN進(jìn)行COMPLETE聚類分析，繪制聚類分析樹狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物篩選及多態(tài)性分析

通過對100對引物組合的篩選，共篩選出24對擴(kuò)增效果好、條帶清晰、多態(tài)性高的引物組合，結(jié)果見表3。利用這24對引物組合對144份海南鉆喙蘭全基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，各樣本均可以擴(kuò)增出清晰、重復(fù)性好、多態(tài)性高的條帶（圖1），擴(kuò)增產(chǎn)物一般在1 500 bp以內(nèi)。24對引物組合共檢測位點(diǎn)390個，其中多態(tài)性位點(diǎn)為299個，占總擴(kuò)增位點(diǎn)的76.9%，表現(xiàn)較豐富的遺傳多樣性。每對引物組合擴(kuò)增的總條帶數(shù)在10～24之間，平均16.2條；多態(tài)性條帶數(shù)在6～19之間，平均12.5條，引物組合Me/8Em7擴(kuò)增的總條帶及多態(tài)性條帶數(shù)最多。

2.2 遺傳多樣性及聚類結(jié)果

144份供試材料的遺傳相似系數(shù)變化范圍為0.508～0.959，平均值為0.691。其中來自東方市板橋鎮(zhèn)中沙村的31號和32號材料之間的相似系數(shù)最大，達(dá)到0.959；瓊中縣紅毛鎮(zhèn)什寒村的97號材料和樂東縣佳西熱帶雨林保護(hù)區(qū)的45號材料相似系數(shù)最小，為0.508；其他材料間的相似系數(shù)大多數(shù)在0.600～0.850之間。

基于SRAP的擴(kuò)增結(jié)果，用COMPLETE法進(jìn)行聚類分析，得到144供試材料的親緣關(guān)系樹狀圖（圖2）。在相似系數(shù)為0.515的水平上，可將144份供試材料分為Ⅰ、Ⅱ 2大組：Ⅰ組包含佳西熱帶雨林保護(hù)區(qū)、阜龍鄉(xiāng)可任、大里鄉(xiāng)小妹、紅毛鎮(zhèn)什寒等居群地的海南鉆喙蘭，其遺傳背景比較近；Ⅱ組包含其余居群地的海南鉆喙蘭。在相似系數(shù)為0.600的水平上，可將Ⅰ組分為Ⅰ1、Ⅰ2、Ⅰ3三個亞組，Ⅱ組分為Ⅱ1、Ⅱ2、Ⅱ3、Ⅱ4、Ⅱ5、Ⅱ6、Ⅱ7、Ⅱ8、Ⅱ9九個亞組。分組結(jié)果顯示，同一采集地點(diǎn)的材料部分聚類在同一亞組，但也存在交叉和相對聚類現(xiàn)象，這與一個居群地存在多種表現(xiàn)型有關(guān)。保亭縣、陵水縣的居群內(nèi)海南鉆喙蘭單株之間葉的大小及葉形存在較大差異，白沙縣、瓊中縣的居群內(nèi)海南鉆喙蘭單株之間花色及大小存在差異，五指山市的材料間花及葉的形態(tài)均存在較大差異。

3 討論

目前，國內(nèi)學(xué)者已經(jīng)利用SRAP標(biāo)記技術(shù)對蘭科植物的遺傳多樣性進(jìn)行了大量的研究，在文心蘭[18]、國蘭[19]、大花蕙蘭[11]、石斛蘭[20]等蘭科植物上均表現(xiàn)出較高的多態(tài)性。本試驗(yàn)利用SRAP標(biāo)記技術(shù)對22個采樣點(diǎn)的144份海南鉆喙蘭材料進(jìn)行種內(nèi)遺傳多樣性分析，多態(tài)性比率為76.9%，相似系數(shù)變化范圍為0.508～0.959，結(jié)果表明：海南島上的野生海南鉆喙蘭資源表現(xiàn)出較高的遺傳多樣性和種內(nèi)變異，該標(biāo)記技術(shù)在海南鉆喙蘭上表現(xiàn)的高多態(tài)性與在其他蘭科植物上相似。

本試驗(yàn)聚類結(jié)果顯示，各材料并未嚴(yán)格地按地理界限聚在一起，同一地點(diǎn)采集的材料多數(shù)能聚類在同一組，少數(shù)則與其他采集地的材料聚在一起。這種交叉聚類現(xiàn)象說明，海南鉆喙蘭種質(zhì)間的遺傳距離與地理距離不完全相關(guān)，該結(jié)果與部分物種的研究結(jié)果類似。洪莉等[21]在對無患子種質(zhì)資源多樣性與親緣關(guān)系的研究結(jié)果表明，各無患子種質(zhì)并未嚴(yán)格按地理界限聚類，而是出現(xiàn)“大雜居、小聚居”的現(xiàn)象，并認(rèn)為不同的適應(yīng)氣候環(huán)境能力導(dǎo)致各分布區(qū)的無患子個體遺傳差異較大。湯正輝等[22]在對河南連翹居群遺傳多樣性研究時亦出現(xiàn)交叉聚類現(xiàn)象，得出連翹居群間遺傳距離與地理距離沒有相關(guān)性，并認(rèn)為連翹本身生物學(xué)特性與生境差異是導(dǎo)致河南連翹遺傳格局的主要原因。對于此類現(xiàn)象，學(xué)者們還有其他看法。楊雪等[23]在對巴山松的遺傳多樣性研究中認(rèn)為居群取樣個體數(shù)、基因位點(diǎn)數(shù)、系統(tǒng)樹構(gòu)建方法都會研究結(jié)果產(chǎn)生影響；李珊等[24]則認(rèn)為遺傳距離與地理尺度有關(guān)，大尺度上遺傳距離與地理距離相關(guān)，而小范圍內(nèi)二者無相關(guān)性。

對于本試驗(yàn)的聚類結(jié)果與地理位置不完全相關(guān)的現(xiàn)象，筆者結(jié)合實(shí)地調(diào)查與結(jié)果分析，認(rèn)為有兩點(diǎn)原因?qū)е略摤F(xiàn)象的產(chǎn)生。其一是海南鉆喙蘭自身生物學(xué)特性及環(huán)境的影響，海南鉆喙蘭多附生于高大的喬木上，其果莢在每年1～4月開裂，適逢海南島干旱季節(jié)以及主要附主木棉（Bombax ceiba Linnaeus）的落葉期，在季風(fēng)氣候影響下海南鉆喙蘭種子易隨風(fēng)散播，使得各海南鉆喙蘭居群地存在多種類型。其二是取樣的地理尺度小。本試驗(yàn)的144份供試材料雖取自海南島的22個不同地點(diǎn)，但海南島的面積小，東北至西南最長距離僅300 km，西北至東南最長距離為180 km，而22個樣本采集點(diǎn)多分布在海南島的西南及中部地區(qū)，它們之間的距離近則幾公里，最遠(yuǎn)不過百余公里，使得本試驗(yàn)的取樣地理尺度相對較小。對于產(chǎn)生該現(xiàn)象的原因推測，還得從后續(xù)的其他分子標(biāo)記技術(shù)以及結(jié)合形態(tài)標(biāo)記，對聚類結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。

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