外源鐵蛋白基因NtFer對粳稻生理影響的研究

唐鑫 華張磊 姜廷波等

摘要[目的] 驗證鐵蛋白基因的功能，提高轉基因粳稻的含鐵量和轉基因粳稻對鹽脅迫和生物脅迫的抗性。[方法]利用農桿菌介導法將煙草鐵蛋白基因NtFer1導入粳稻基因組。[結果]對T0、T1代卡那霉素抗性植株PCR、Southern雜交、Northern雜交和RT-PCR檢測分析表明，外源基因已整合到粳稻基因組中，并能夠穩(wěn)定遺傳表達。轉基因粳稻超氧化物歧化酶（SOD）活性、過氧化氫酶（CAT）活性和葉綠素相對含量高于對照，丙二醛（MDA）含量低于對照，其根、葉片和糙米中鐵含量均高于對照。接種稻瘟病病菌后轉基因植株葉瘟指數低于對照。[結論] 轉入外源鐵蛋白基因NtFer1能夠提高粳稻的含鐵量和轉基因粳稻對鹽脅迫和生物脅迫的抗性。

關鍵詞鐵蛋白；轉基因；粳稻；稻瘟病

中圖分類號S188文獻標識碼A文章編號0517-6611（2014）23-07718-05

基金項目國家科技支撐項目（2011BAD16B11）；“十二五”農村領域國家科技計劃項目（2011BAD35B02-01）。

作者簡介唐鑫華（1982- ），男，黑龍江佳木斯人，實驗師，在讀博士，從事水稻遺傳育種研究。*通訊作者，教授，博士生導師，從事水稻遺傳育種研究。

收稿日期20140704鐵蛋白（Ferritin）廣泛存在于生物體中，是由24個同源或異源亞基組成的450 kD復合體，由1個球形蛋白質外殼包裹，鐵離子能夠在這種復合體中濃縮，每個鐵蛋白分子可以儲藏0～4 500個可溶的、無毒的、可利用的鐵離子，是迄今唯一能夠調控鐵離子從固相轉到液相的蛋白[1-5]。鐵蛋白的一個主要作用是儲存鐵離子，作為植物體光合作物和固氮的鐵源；另一個主要作用是作為脅迫反應蛋白，促進過剩鐵離子的儲藏[6-8]。

鐵是植物生長發(fā)育所必需的元素之一。植物缺鐵葉綠素含量減少、葉片黃化，導致植物出現(xiàn)失綠癥[9-10]；鐵過量時會導致氧化脅迫，催化Fenton反應生成強氧化性的羥自由基，可導致細胞死亡。研究表明將豌豆鐵蛋白基因轉入水稻，轉基因水稻的葉片與非轉基因水稻相比對氧化脅迫的耐受能力有不同程度的增強[11]；將大豆鐵蛋白基因轉入煙草中，轉基因煙草的生長量明顯高于非轉基因煙草株系，葉片中鐵含量提高2～3倍，根中鐵還原酶提高2倍以上，通過鐵貯存能力的提高對除草劑造成的氧化脅迫抗性也有增強[12]；將紫花苜蓿鐵蛋白基因轉入煙草，獲得的轉基因煙草對除草劑百草枯引起的氧化脅迫抗性增強[13]。筆者利用農桿菌介導法將煙草鐵蛋白基因轉入粳稻中，以驗證鐵蛋白基因的功能，提高轉基因粳稻的含鐵量和轉基因粳稻對鹽脅迫和生物脅迫的抗性。

1材料與方法

1.1材料試驗使用的粳稻品種為松粳6（Songjing6），煙草鐵蛋白基因NtFer1（GenBank登錄號：AB083924）由東北林業(yè)大學林木遺傳育種國家重點實驗室前期研究獲得。 煙草鐵蛋白NtFer1基因cDNA編碼區(qū)全長756 bp，編碼251氨基酸。

1.2方法

1.2.1載體構建與農桿菌培養(yǎng)。將獲得的煙草鐵蛋白基因NtFer1cDNA片段插入植物表達載體PBI121中替代GUS基因，啟動子為CaMV35S，終止子為NOS，具有卡那霉素抗性，用凍融法將測序確認后的質粒導入農桿菌EHA105中。

將含有NtFer1載體的農桿菌涂布于LB固體培養(yǎng)基上（卡那霉素Km 50 mg/L、利福平Rif50 mg/L），27 ℃暗培養(yǎng)至菌斑清晰可見，挑取菌斑至LB培養(yǎng)液（Km 50 mg/L、Rif 50 mg/L），27 ℃、160 r/min，培養(yǎng)12～16 h，取500 μl上述培養(yǎng)液加入100 ml YEB液體培養(yǎng)基中待OD值在0.4～0.5時，侵染備用。

1.2.2粳稻轉化。將松粳6的成熟種子脫去外殼，經75%乙醇 1 min、HgCl2和5%NaClO 20 min 消毒處理后無菌水沖洗干凈，播入愈傷誘導培養(yǎng)基；14 d后剝離愈傷組織至愈傷繼代培養(yǎng)基；10 d后轉入預培養(yǎng)基，25 ℃暗培養(yǎng)4 d。

在超凈工作臺內將愈傷組織浸沒于農桿菌EHA105菌液中30 min，并每隔5 min晃動1次，取出愈傷組織吸干表面菌液于共培養(yǎng)基中，20 ℃暗培養(yǎng)3 d。經過篩選、分化和生根培養(yǎng)后，將獲得的小苗移入氣候箱營養(yǎng)液培養(yǎng)，收獲種子。將轉基因植株的T1代播種于MS培養(yǎng)基（Km 120 mg/L+ Fe2+300 umol/L），進一步研究生理特性等。

愈傷誘導：NMB+2 mg/L 2，4D+1 mg/L 6BA+1 g/L CH+600 mg/L L脯氨酸+7 g/L瓊脂+30 g/L蔗糖，pH 5.8；愈傷繼代：NMB+1 mg/L 2，4D+0.5 mg/L 6BA+1 g/L CH+600 mg/L L脯氨酸+7.5 g/L瓊脂+30 g/L 蔗糖，pH 5.8；預培養(yǎng)和共培養(yǎng)基：NMB+1 mg/L 2，4D+0.5 mg/L 6BA+1 g/L CH+600 mg/L L脯氨酸+120 mg/L AS+7.5 g/L瓊脂+30 g/L 蔗糖，pH 5.8；篩選培養(yǎng)基1：NMB+1 mg/L 2，4D+0.5 mg/L 6BA+1 g/L CH+600 mg/L L脯氨酸+50 mg/L Km+500 mg/L Cef+7.5 g/L瓊脂+3 0g/L 蔗糖，pH 5.8；篩選培養(yǎng)基2：NMB+1 mg/L 2，4D+0.5 mg/L 6BA+1 g/L CH+600 mg/L L脯氨酸+120 mg/L Km+300 mg/L Cef+7.5 g/L瓊脂+30 g/L 蔗糖，pH 5.8；分化培養(yǎng)基：NMB+2 mg/L 6BA+1 mg/L KT+0.5 mg/L NAA+1 g/L CH+600 mg/L L脯氨酸+120 mg/L Km+300 mg/L Cef+7 g/L瓊脂+30 g/L 蔗糖，pH 5.6；生根培養(yǎng)基：1/2 MS+300 umol/L Fe2++0.2 mg/L NAA+120 mg/L Km+200 mg/L Cef+6 g/L 瓊脂，pH 5.4；壯苗培養(yǎng)液1：MS+300 μmol/L Fe2+，pH 5.2；壯苗培養(yǎng)液2：Ms（N×1.5）+300 umol/L Fe2+，pH 5.2。

1.2.3T0代轉基因粳稻分子檢測。用試劑盒（原平皓，HF224）提取植株葉片總DNA。應用Primer Premier 5.0設計特異引物，NtFer1F（5CCA CTA TCC TTC GCA AGA CCC TTC C3）和NtFer1R（5CAT CGC AAG ACC GGC AAC AGG ATT C3），PCR反應體積20 μl，反應體系：模板0.5 μg，100 μmol/L引物各0.1 ul，10×Buffer（含Mg2+）2.0 μl，2.5 mmol/L dNTP 2 μl，5 μ/μl Taq 0.2 μl。反應條件：94 ℃2 min；94 ℃ 30 s，58.5 ℃ 30 s，72 ℃1 min，30個循環(huán)；72 ℃10 min。PCR產物經1%凝膠電泳分離成像。用DIG標記探針試劑盒（Roche）標記煙草鐵蛋白基因NtFer1cDNA為探針，參照《分子克隆實驗指南》方法進行Southern雜交。

用Trizol 法提取葉片總RNA，取30 μg總RNA 65 ℃水浴5 min，經1%甲醛變性膠電泳分離后轉移至尼龍膜上Northern雜交，方法同Southern雜交。

1.2.4T1代轉基因粳稻分子檢測分析。用Trizol 法提取葉片和根部總RNA，參照試劑盒（Toyobo，Japan）說明書反轉錄成cDNA，以水稻Actin1基因為內參基因，外源基因特異引物為：NtFer1RTF（5AGG AGT TGA TGC TTG TAC CC3）和NtFer1RTR（5TTC TCA GCG TGC TCT CTT TC3），內參基因特異引物為：Actin1RTF（5ATC CTT GTA TGC TAG CGG TCG A3）和Actin1RTR（5ATC CAA CCG GAG GAT AGC ATG3）。擴增反應程序：95 ℃30 s，94 ℃30 s、58 ℃30 s、72 ℃30 s、42個循環(huán)；熔解程序：94 ℃30 s，94～60 ℃臺階溫度0.5 ℃保持1 min，94 ℃30 s。PCR檢測同“1.2.3”。

1.2.5T1代轉基因粳稻生理指標和葉綠素相對含量測定。經卡那霉素篩選在壯苗培養(yǎng)液1中生長60 d后測量植株上部鮮活葉片生理指標等。超氧化物歧化酶（SOD）活性用氮藍四唑光化學還原法測定，過氧化物酶（POD）活性用愈創(chuàng)木酚法測定，過氧化氫酶（CAT）活性用紫外吸收法測定，丙二醛（MDA）含量用硫代巴比妥酸比色法測定，葉綠素相對含量利用SPAD502葉綠素儀（美能達，Japan）測定。

1.2.6T1代轉基因粳稻Fe、Zn含量測定。根據Fe、Zn標準繪制標準曲線，濕式消解-原子吸收法（原子吸收分光光度計Z2000，Japan）測定葉片、根和糙米中Fe、Zn含量，重復3次，并計算樣品加標回收率。

1.2.7T1代轉基因粳稻稻瘟病抗性分析。 采集黑龍江省水稻主產區(qū)2010～2012年稻瘟病樣本，分離62個單孢菌株高粱培養(yǎng)基培養(yǎng)，待生成大量分生孢子時將菌體懸浮液調成濃度2×105孢子/ml，每個菌株懸浮液取10 ml加入0.02%Tween20混勻，噴霧器均勻噴灑三葉一心幼苗，27 ℃，濕度90%，暗培養(yǎng)24 h，然后保持27 ℃，濕度90%，光照12 h/d，8、10和12 d調查葉瘟級別，葉瘟級別按國際水稻所稻瘟病抗性評價分級標準，根據病情指數公式計算病情指數[14-15]，計算公式如下：

病情指數=各級發(fā)病數×相應級數調查總數×最高級數×100

2結果與分析

2.1T0代轉基因粳稻的分子檢測為了從分子水平上證明煙草鐵蛋白NtFer1基因cDNA是否整合到松粳6基因組中，對卡那霉素抗性植株進行PCR檢測，結果表明卡那霉素抗性植株和陽性對照質粒均在750 bp處擴增出目的條帶，而陰性對照的非轉基因植株則無擴增條帶出現(xiàn)（），初步證明外源基因整合到松粳6基因組中。從擴增出目的條帶的轉基因植株中選出3株長勢較好的植株，進行Southern blot檢測，轉基因株系均能與探針雜交出條帶（），進一步證明外源基因已整合到松粳6基因組中；分離總RNA進行Northern blot檢測，分析表明在轉基因植株中均檢測到了相應的外源基因NtFer1表達的mRNA信號（），說明外源基因NtFer1已在轉錄水平表達。

注：1.Marker2000；2.陽性對照；3.非轉基因對照；4～9.轉基因植株。

T0代轉基因植株PCR電泳圖譜注：1.Marker2000；2.非轉基因對照；3.陽性對照；4～6.轉基因植株。

T0代轉基因植株Southern雜交注：1.非轉基因對照；2～4.轉基因植株。

T0代轉基因植株Northern雜交2.2T1代轉基因粳稻分子檢測T1代轉基因粳稻Nt1、Nt2和Nt3 3個株系PCR檢測，結果表明卡那霉素抗性植株和陽性對照質粒均在750 bp處擴增出目的條帶，而非轉基因對照植株則無擴增條帶出現(xiàn)（），證明外源基因在轉基因植株中穩(wěn)定遺傳；RTPCR檢測表明，煙草鐵蛋白NtFer1基因在Nt1、Nt2和Nt3 3個株系均有表達，且相同株系植株相對表達量無顯著差異，而非轉基因對照株系則無表達（）。

注：1.Marker2000；2.陽性對照；3.非轉基因對照；4～6.轉基因株系Nt1；7～9.轉基因株系Nt2；10～12.轉基因株系Nt3。

T1代轉基因植株PCR電泳圖譜注：CK.非轉基因對照；Nt1、Nt2、Nt3.轉基因株系。

RTPCR檢測分析2.3T1代轉基因粳稻生理指標和葉綠素相對含量分析SOD、CAT和POD在植物抗氧化脅迫中具有清除氧自由基和維持活性氧代謝平衡的功能，具有防止質膜過氧化的功能[16-19]。植物器官衰老或在逆境下遭受傷害，往往發(fā)生膜脂過氧化作用，MDA是膜脂過氧化的最終分解產物，其含量可以反映植物遭受逆境傷害的程度。在轉基因株系中SOD活性、CAT活性顯著高于非轉基因對照22.9%、12.2%（、7），POD活性亦高于對照，但差異不顯著。轉基因株系MDA含量低于對照11.3%，且差異顯著（）。上述差異表明，轉入的外源鐵蛋白基因NtFer1的表達能夠提高轉基因植株的抗氧化酶活性從而降低或抑制質膜過氧化水平。

注：CK.非轉基因對照；Nt.轉基因植株。

SOD活性 注：CK.非轉基因對照；Nt.轉基因植株。

CAT活性注：CK.非轉基因對照；Nt.轉基因植株。

MDA含量葉綠素是綠色植物進行光合作用的基礎物質，是植物葉片的主要光合色素，研究表明[20-22]，葉片葉綠素含量與葉綠素儀所測定的SPAD值有良好的一致性。葉綠素相對含量轉基因株系高于對照15.6%，且差異顯著（）。

注：CK.非轉基因對照；Nt.轉基因植株。

葉綠素相對含量安徽農業(yè)科學2014年2.4T1代轉基因粳稻Fe、Zn含量Fe、Zn標準曲線（0）、加標回收率和相對標準偏差（）符合試驗要求。轉基因植株根部Fe含量高于非轉基因對照11.0%，葉片F(xiàn)e含量高于對照32.6%，糙米Fe含量高于對照18.7%（1）。在轉基因和非轉基因對照植株根部FeZn含量呈顯著正相關；而葉片和糙米中FeZn含量呈顯著負相關，轉基因植株的FeZn負相關系數低于對照（）。表明轉入外源鐵蛋白基因能夠提高轉基因植株組織和器官中Fe含量，同時降低FeZn拮抗程度，有利于營養(yǎng)元素的吸收與利用。

0Fe、Zn標準曲線回收率%

元素回收率RSDFe94.3～97.62.13Zn94.7～98.31.78

FeZn含量關系

株系根 FeZn含量關系葉片糙米CK0.243*-0.759*-0.81*Nt0.583*-0.338*-0.720*

注：a.根部；b.葉片；c.糙米；CK.非轉基因對照；Nt.轉基因植株。

1鐵含量2.5稻瘟病抗性分析轉基因植株的葉片在8、10和12 d稻瘟病病斑數量少于非轉基因對照，面積小于非轉基因對照（2），葉瘟病情指數低于非轉基因對照14.4%～15.9%且差異顯著（3）。

注：CK.非轉基因對照；Nt.轉基因植株。

2葉片病情比較注：CK.非轉基因對照；Nt.轉基因植株。

3葉片病情指數3結論與討論

通過對轉基因植株和對照的比較分析，表明轉入外源鐵蛋白基因NtFer1能夠提高粳稻的根、葉片和糙米中鐵離子含量，同時提高了轉基因植株SOD、CAT活性和葉綠素相對含量，MDA含量則相反，能夠抑制稻瘟病病菌對葉片的傷害。

轉入外源鐵蛋白基因NtFer1通過提高鐵蛋白的表達量，從而增加植物體內組織和器官貯藏鐵離子的能力，增加了鐵含量。過氧化氫酶（CAT）是以鐵卟啉為輔基的結合酶；葉綠素的合成必須有鐵的存在，鐵是合成葉綠素中卟啉環(huán)的前體物質[23]。葉片鐵含量的增加可以促進CAT和葉綠素的合成。Zn是SOD輔基的一種組成成分，在Fe過量的情況下FeZn呈負相關，而轉基因植株的負相關系數低于對照，其Zn含量高于對照，故轉基因植株SOD活性高于對照。SOD和CAT活性的提高，加速了植物體內O2-、H2O2、HO·的分解清除能力，降低質膜氧化作用，抑制MDA含量上升。鐵蛋白作為一種脅迫反應蛋白，當葉片受到稻瘟病病菌侵染鐵蛋白釋放出貯藏的鐵離子，產生Fenton反應生成具有強氧化力的羥自由基（·OH）以達到抑制病菌生長的目的[7，24]，有助于提高作物抗性從而增加產量。

在該試驗中轉基因植株和對照根部鐵含量高于葉片的30～40倍，高于糙米的80～120倍，根部能夠吸收和聚集大量的鐵離子保障對其他組織和器官的供給，但葉片和糙米的鐵含量遠低于根部，其原因可能有三方面：一是粳稻對鐵離子的轉運能力不高造成；二是植株其他組織和器官自身調節(jié)和保護機制避免過量鐵離子的富集對其毒害；三是受組織和器官中鐵離子貯藏能力限制。雖然轉入的外源鐵蛋白基因NtFer1能夠提高植株鐵離子的貯藏能力，但這種提高程度依然受到植物體固有的機能制約和調控。

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