亞?wèn)|鮭線(xiàn)粒體COⅠ與 COⅡ基因遺傳多樣性分析

李福貴 鄒曙明

摘要[目的] 分析亞?wèn)|鮭線(xiàn)粒體COⅠ與 COⅡ基因遺傳多樣性。[方法] 分別從西藏亞?wèn)|河與亞?wèn)|鮭養(yǎng)殖站采集野生與養(yǎng)殖亞?wèn)|鮭各15尾樣品，對(duì)其線(xiàn)粒體DNA COⅠ、COⅡ基因全序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增、測(cè)序比對(duì)。[結(jié)果]序列長(zhǎng)度分別為631、634 bp。序列分析結(jié)果顯示：30條亞?wèn)|鮭線(xiàn)粒體DNA COⅠ 、COⅡ序列分別檢測(cè)到1種、3種單倍型，均無(wú)堿基插入、缺失，COⅡ序列有2個(gè)位點(diǎn)出現(xiàn)堿基替換；COⅠ 、COⅡ序列T、C、A和G堿基平均含量分別為29.5%、28.97%，30.6%、28.47%，22.5%、27.03%和17.4%、15.53%，其中A+T的含量（52.0%、56.0%）均顯著高于G+C含量（48.0%、44.0%），均表現(xiàn)出明顯的堿基偏倚；COⅠ 、COⅡ單倍型多態(tài)性（h）與核苷酸多態(tài)性（π） 值分別為0、0.80與0、0.000 1；根據(jù)Kimura雙參數(shù)模型構(gòu)建基于線(xiàn)粒體COⅠ、COⅡ序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，兩亞?wèn)|鮭魚(yú)遺傳距離分別為0、0.002 4。[結(jié)論]西藏亞?wèn)|鮭的遺傳多樣性水平較低，且養(yǎng)殖和野生群體無(wú)遺傳分化。

關(guān)鍵詞亞?wèn)|鮭；COⅠ基因；COⅡ基因；序列特征；遺傳機(jī)制；遺傳分化

中圖分類(lèi)號(hào)S188文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2014）23-07710-04

基金項(xiàng)目農(nóng)業(yè)部公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專(zhuān)項(xiàng)（201203086）；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31272633，31201760）；上海高校知識(shí)服務(wù)平臺(tái)（ZF1206）。

作者簡(jiǎn)介李福貴（1987-），男，江西贛州人，博士研究生，研究方向：水產(chǎn)養(yǎng)殖學(xué)。*通訊作者。

收稿日期20140708亞?wèn)|鮭（Salmo truttafraio Linne ）屬鮭形目、鮭科、鮭屬，又名河鮭，是分布于我國(guó)西藏地區(qū)的一種冷水性經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)，原產(chǎn)歐洲、非洲和西亞等地區(qū)，19世紀(jì)由英國(guó)人自歐洲引種，1992年被列入西藏自治區(qū)二級(jí)重點(diǎn)保護(hù)水生動(dòng)物[1-6]。在西藏地區(qū)已有較大規(guī)模的亞?wèn)|鮭人工養(yǎng)殖和繁殖。隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大，亞?wèn)|鮭種質(zhì)資源退化現(xiàn)象日趨嚴(yán)重。目前關(guān)于亞?wèn)|鮭的研究主要涉及形態(tài)學(xué)、繁殖生物學(xué)和分子生物學(xué)等方面[4-11]。

筆者測(cè)定了2個(gè)群體亞?wèn)|鮭（各15尾）COⅠ、COⅡ基因序列，分別與其他幾種鮭科魚(yú)類(lèi)相同基因同源序列進(jìn)行比對(duì)和分析、構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)等，從基因水平上揭示自繁后代與野生群體的遺傳變異，以期通過(guò)分析2個(gè)種群的遺傳結(jié)構(gòu)差異及多樣性，探討外來(lái)種在長(zhǎng)期的高原環(huán)境壓力下是否會(huì)發(fā)生顯著性的遺傳變化、基因漂變，為合理保護(hù)和利用亞?wèn)|鮭自然種質(zhì)資源提供科學(xué)依據(jù)和指導(dǎo)，也為提高亞?wèn)|鮭養(yǎng)殖性狀、培育優(yōu)良品種累積數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料所用30尾亞?wèn)|鮭樣品分別來(lái)源于西藏亞?wèn)|河和西藏自治區(qū)亞?wèn)|鮭養(yǎng)殖站，大西洋鮭、紅點(diǎn)鮭、虹鱒COⅠ序列以及褐鱒、大鱗大麻哈魚(yú)、北極紅點(diǎn)鮭和虹鱒COⅡ序列均來(lái)自于GenBank，具體采樣信息見(jiàn)。魚(yú)鰭樣品均用無(wú)水乙醇固定，于-20 ℃冰箱保存。

1.2 COⅠ、COⅡ引物序列用于擴(kuò)增亞?wèn)|鮭COⅠ、COⅡ基因片段的通用引物由上海生工（Sangon）合成，引物序列YDCOⅠ-F：5TCA ACC AAC CAC AAA GAC ATT GGC AC3；YDCOⅠ-R：5TAG ACT TCT GGG TGG CCA AAG AAT CA3；YDCOⅡ-F：5ATGGCACATCCCTCACAACTAGGATT3；YDCOⅡ-R：5AGGCATCTTCAAGTAGGATAGTGGATCA3。

1.3 基因組DNA提取、PCR擴(kuò)增和測(cè)序試驗(yàn)前將魚(yú)鰭從乙醇中取出，用蒸餾水洗凈、吸水紙吸干、剪碎，按照海洋動(dòng)物組織DNA抽提法（天根試劑盒）提取基因組DNA。用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)抽提DNA的質(zhì)量和濃度。稀釋DNA到合適濃度用于PCR擴(kuò)增。選取6組退火溫度（53、54、55、56、57、58 ℃）進(jìn)行梯度PCR，最終確定55、56 ℃分別為最佳退火溫度。PCR反應(yīng)體積為50 μl，程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min，然后35循環(huán)（95 ℃變性35 s，54 ℃退火35 s，72 ℃延伸1 min）72 ℃再延伸10 min，4 ℃保存。以上反應(yīng)均設(shè)置陰性對(duì)照排除DNA污染。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，由上海生工完成測(cè)序。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析將雙向測(cè)序獲得的序列進(jìn)行拼接，然后在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blast同源性搜索，經(jīng)驗(yàn)證確定為基因序列結(jié)果。利用MEGA 4.10軟件進(jìn)行序列排列，同時(shí)輔以人工較對(duì)，并進(jìn)行序列比較和變異檢測(cè)，確定變異位點(diǎn)和單倍型，采用DNA SP4.10軟件計(jì)算單倍型多樣性（Haplotype diversity，Hd）、核苷酸多樣性（Nucleotide diversity，Pi）和核苷酸歧異度（ Pairwise divergence）。用Arlequin3.01軟件中的分子變異分析（AMOVA ） 方法估算遺傳變異在群體間和群體內(nèi)的分布，并計(jì)算群體間遺傳分化系數(shù)（F-statistics，F(xiàn)st） 及其顯著性（重復(fù)次數(shù)1 000），群體間基因流計(jì)算公式：Nm=（1/Fst-1）/2。對(duì)測(cè)得序列堿基組成及序列間堿基替代數(shù)、差異位點(diǎn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，基于Kimura雙因子參數(shù)模型構(gòu)建NJ樹(shù)，分析鮭科魚(yú)類(lèi)種間親緣關(guān)系，并對(duì)所得系統(tǒng)樹(shù)進(jìn)行自展法檢驗(yàn)1 000次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 COⅠ、COⅡ序列同源分析及變異位點(diǎn)比較PCR 擴(kuò)增得到野生與自繁F1后代養(yǎng)殖亞?wèn)|鮭30個(gè)個(gè)體清晰的COⅠ、COⅡ擴(kuò)增帶。經(jīng)測(cè)序比對(duì)分別得到631、634 bp基因片段。與GenBank中其他鮭科魚(yú)類(lèi)mtDNA COⅠ、COⅡ序列進(jìn)行Blast比對(duì)，相同基因片段的同源性分別達(dá)96%、92%以上。

種鮭科魚(yú)類(lèi)COⅡ基因片段變異位點(diǎn)比較30條COⅠ序列僅檢測(cè)到1種單倍型，沒(méi)有出現(xiàn)堿基的插入、缺失、替換。與大西洋鮭、紅點(diǎn)鮭及虹鱒同源序列比對(duì)得到613 bp比對(duì)位點(diǎn)。35條同源序列共發(fā)現(xiàn)6種單倍型，其中野生和養(yǎng)殖亞?wèn)|鮭30個(gè)體序列完全相同，共享一種單倍型。30條COⅡ序列檢測(cè)到3種單倍型（野生2種，養(yǎng)殖1種），沒(méi)有出現(xiàn)堿基的插入與缺失。與大西洋鮭及紅點(diǎn)鮭COⅡ同源序列比對(duì)得到620 bp比對(duì)位點(diǎn)，共檢測(cè)到92條（14.8%）變異位點(diǎn)。35條同源序列共發(fā)現(xiàn)8種單倍型，其中野生和養(yǎng)殖亞?wèn)|鮭30個(gè)體序列有個(gè)別堿基差異，各有2種和1種單倍型，用ysyd1、ysyd2與yzyd表示；褐鱒2個(gè)體存在2種單倍型，用a1-2表示；大鱗大麻哈魚(yú)1個(gè)體存在1種單倍型，用b1表示；北極紅點(diǎn)鮭1個(gè)體存在1種單倍型，用c1表示；虹鱒1個(gè)體存在1種單倍型，用d1表示（）。

2.2 鮭科魚(yú)類(lèi)COⅠ、COⅡ堿基組成比較利用MEGA 5.05 軟件分析COⅠ、COⅡ堿基組成見(jiàn)～3。從堿基組成的偏向性來(lái)看，G含量最低，A+T含量大于C+G含量，表現(xiàn)出明顯的堿基偏倚，且鮭科魚(yú)類(lèi)COⅠ、COⅡ序列堿基含量特征均高度相似，這與脊椎動(dòng)物線(xiàn)粒體DNA的特點(diǎn)相一致[12]。

2.3 亞?wèn)|鮭種群COⅠ、COⅡ序列遺傳多樣性分析用MEGA5.05軟件確定30個(gè)亞?wèn)|鮭樣本COⅠ、COⅡ序列單倍型，同時(shí)統(tǒng)計(jì)單倍型及多態(tài)位點(diǎn)（s），計(jì)算單倍型多樣性（h）、平均核苷酸差異數(shù) （k） 及核苷酸多樣性（π） （）。COⅠ 沒(méi)有變異位點(diǎn)，單倍型多態(tài)性與核苷酸多態(tài)性值均為0；COⅡ 鮭科魚(yú)類(lèi)COⅠ堿基組成的比較

種名堿基含量∥%TCAGA+TG+C野生亞?wèn)|鮭29.530.622.517.452.048.0大西洋鮭31.728.722.417.254.145.9大西洋鮭31.029.222.916.953.946.1大西洋鮭31.529.022.517.054.046.0紅點(diǎn)鮭 29.229.423.018.452.247.8虹鱒 29.629.622.618.252.247.8平均30.329.622.617.552.947.1

鮭科魚(yú)類(lèi)COⅡ堿基組成的比較

序列共檢測(cè)到2個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，占分析位點(diǎn)總數(shù)的0.3%，單倍型多態(tài)性為0.978，核苷酸多態(tài)性為0.000 1。 亞?wèn)|鮭線(xiàn)粒體COⅠ、COⅡ序列遺傳多樣性參數(shù)

類(lèi)群樣本數(shù)亞?wèn)|鮭線(xiàn)粒體COⅠ單倍

型數(shù)單倍型

多樣性多態(tài)

位點(diǎn)平均核苷

酸差異數(shù)核苷酸多

樣性指數(shù)亞?wèn)|鮭線(xiàn)粒體COⅡ單倍

型數(shù)單倍型

多樣性多態(tài)

位點(diǎn)平均核苷

酸差異數(shù)核苷酸多

樣性指數(shù)養(yǎng)殖151000010000野生151000020.93310.066 670.000 1總體301000030.97820.066 670.000 1

2.4 鮭科魚(yú)類(lèi)COⅠ、COⅡ遺傳距離及系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系根據(jù)Kimura雙參數(shù)模型構(gòu)建基于亞?wèn)|鮭魚(yú)COⅠ序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（），得到5種鮭科魚(yú)類(lèi)遺傳距離，其中野生和養(yǎng)殖亞?wèn)|鮭共30尾序列完全相同，在進(jìn)化樹(shù)上位于同一位置。而與大西洋鮭、紅點(diǎn)鮭、虹鱒遺傳距離為0.03～0.06，彼此之間距離均大于種間鑒定最小遺傳距離（2%）[7]。說(shuō)明野生和養(yǎng)殖亞?wèn)|鮭基本無(wú)分化。

根據(jù)COⅠ基因序列構(gòu)建的NJ 系統(tǒng)樹(shù)根據(jù)Kimura雙參數(shù)模型構(gòu)建基于亞?wèn)|鮭魚(yú)COⅡ序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（），得到5種鮭科魚(yú)類(lèi)遺傳距離，其中亞?wèn)|鮭與褐鱒遺傳距離最小，均小于0.002 4；與北極紅點(diǎn)鮭遺傳距離最大，為0.054 2；亞?wèn)|鮭與大鱗大馬哈魚(yú)、虹鱒遺傳距離分別為0.031 2、0.039 0。結(jié)果顯示，野生型和養(yǎng)殖型交錯(cuò)在一起，未表現(xiàn)出明顯差異，說(shuō)明野生和養(yǎng)殖亞?wèn)|鮭基本無(wú)分化。

安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)2014年根據(jù)COⅡ基因序列構(gòu)建的NJ 系統(tǒng)樹(shù)3結(jié)論與討論

3.1 線(xiàn)粒體 COⅠ序列同質(zhì)性該研究結(jié)果顯示，COⅠ基因在野生和自繁F1后代養(yǎng)殖亞?wèn)|鮭種群之間無(wú)任何差異。這種同質(zhì)性可能是由于一個(gè)相似的亞分化[13]造成的，而這種同質(zhì)性產(chǎn)生原因可能是由2個(gè)種群內(nèi)在的親緣關(guān)系。亞?wèn)|鮭魚(yú)引入我國(guó)西藏后，在高原環(huán)境下繁衍生殖了100多年，隨著人工捕撈和自然災(zāi)害的頻頻發(fā)生，自然選擇壓力之下野生種群數(shù)量勢(shì)必下降。人工繁殖的親魚(yú)均是從河中捕撈引進(jìn)，它們大多數(shù)個(gè)體是同一尾或者幾尾雌魚(yú)產(chǎn)生的后代。另外對(duì)野生和養(yǎng)殖的30尾魚(yú)COⅠ基因測(cè)序，沒(méi)有檢測(cè)到不同的單倍形個(gè)體。這表明亞?wèn)|鮭還沒(méi)有達(dá)到在線(xiàn)粒體 DNA水平的較大變異。

3.2 亞?wèn)|鮭COⅡ序列差異序列沒(méi)有發(fā)生任何堿基的插入和缺失，A、T、C、G 4種核苷酸在線(xiàn)粒體基因組中的分布呈不均一性，是動(dòng)物線(xiàn)粒體基因組的一個(gè)共性[14]。該研究所得到的亞?wèn)|鮭COⅡ區(qū)中，A+T的含量（56%）顯著高于G+C含量（44%），這與其他魚(yú)類(lèi)線(xiàn)粒體COⅡ基因序列結(jié)果類(lèi)似[15]，也與邵愛(ài)華等[16]統(tǒng)計(jì)的15種魚(yú)類(lèi)堿基平均組成相似，表明A+T含量高可能也是魚(yú)類(lèi)mtDNA COⅡ基因堿基組成中普遍存在的現(xiàn)象。在DNA進(jìn)化過(guò)程中，堿基轉(zhuǎn)換（TS）發(fā)生的頻率高于顛換（TV），該研究結(jié)果與此相符。

該試驗(yàn)樣本來(lái)自于西藏自治區(qū)亞?wèn)|鮭養(yǎng)殖站，其親本來(lái)源于亞?wèn)|河，系多代養(yǎng)殖品種。擴(kuò)增的30尾亞?wèn)|鮭COⅡ序列幾乎完全相同，只有2個(gè)位點(diǎn)出現(xiàn)堿基變異，這可能與其長(zhǎng)期近親繁殖導(dǎo)致種質(zhì)資源退化遺傳多樣性降低有關(guān)。

3.3 亞?wèn)|鮭群體COⅠ、COⅡ的遺傳多樣性水平 核苷酸多態(tài)性（Pi）和單倍型平均遺傳距離（P）是衡量一個(gè)種群mtDNA遺傳變異的2個(gè)重要指標(biāo)。其中Pi考慮了各種mtDNA單倍型在群體中所占的比例，所以在反映一個(gè)群體的mtDNA多態(tài)程度時(shí)往往比單純的遺傳距離平均值更精確[17]。該研究結(jié)果顯示，基于線(xiàn)粒體COⅠ基因片段亞?wèn)|鮭群體均具有較低的核苷酸多樣性（Pi<0.005） 和較低的單倍型多樣性（Hd<0.8），而基于線(xiàn)粒體COⅡ基因片段，亞?wèn)|鮭群體均具有較低的核苷酸多樣性（Pi<0.005） 和較高的單倍型多樣性（Hd >0.8），因此筆者分析得出亞?wèn)|鮭養(yǎng)殖群體和自繁F1后代野生群體均具有較低的遺傳多樣性水平，這與其他物種養(yǎng)殖群體較低的遺傳多樣性結(jié)果一致，說(shuō)明該研究中的亞?wèn)|鮭受人工養(yǎng)殖環(huán)境的及近親繁殖等影響，養(yǎng)殖過(guò)程中出現(xiàn)輕微衰退，同時(shí)也預(yù)示著保護(hù)亞?wèn)|鮭遺傳多樣性工作的重要性。

進(jìn)行物種間鑒定的重要標(biāo)志是種內(nèi)和種間遺傳距離的大小，較大的種間差異是對(duì)物種進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定的先決條件。加拿大動(dòng)物學(xué)家推薦物種鑒定最小種間遺傳距離為2%，COⅠ序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)顯示，野生和自繁F1后代養(yǎng)殖亞?wèn)|鮭共30尾序列完全相同，遺傳距離相同，在進(jìn)化樹(shù)上位于同一位置，而與大西洋鮭、紅點(diǎn)鮭、虹鱒遺傳距離為0.03～0.06，彼此之間距離均大于種間鑒定最小遺傳距離（2%）[7]。說(shuō)明野生和養(yǎng)殖亞?wèn)|鮭基本無(wú)分化。COⅡ序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)顯示，褐鱒與亞?wèn)|鮭魚(yú)間遺傳距離均小于0.002 4，說(shuō)明褐鱒即棕鱒、亞?wèn)|鮭是其亞種；而亞?wèn)|鮭與大鱗大麻哈魚(yú)、虹鱒、北極紅點(diǎn)鮭魚(yú)間遺傳距離為0.029 4～0.054 2，大于2%這一臨界值，表明利用COⅡ基因序列片斷可以有效地進(jìn)行這幾種鮭科魚(yú)類(lèi)物種的鑒定。

綜上，該研究中的亞?wèn)|鮭養(yǎng)殖群體和野生群體均具有較低的遺傳多樣性，因此，筆者建議種苗繁育場(chǎng)在進(jìn)行人工繁殖時(shí)，盡量采用多種來(lái)源及遺傳距離較遠(yuǎn)的不同親魚(yú)群體進(jìn)行繁殖，避免近交衰退帶來(lái)的風(fēng)險(xiǎn)，從而有利于豐富亞?wèn)|鮭苗種的遺傳多樣性。

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