吉爾吉斯白樺BkWRKY基因克隆與序列分析

田玉富 崔璨 謝龍飛等

摘要從吉爾吉斯白樺轉(zhuǎn)錄組文庫測序中獲得白樺BkWRKY1轉(zhuǎn)錄因子的cDNA序列，該序列包含2 189個(gè)堿基。序列比對(duì)和同源性分析表明，該基因cDNA序列包含1 728 bp的開放閱讀框，可編碼575個(gè)氨基酸，5′非翻譯區(qū)（UTR）為119 bp，3′非翻譯區(qū)（UTR）為342 bp。該基因?qū)儆赪RKY transcription factor家族，含有2個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域，蛋白分子量為62.483 kD，理論等電點(diǎn)為7.32，負(fù)電荷殘基（Asp+Glu）總數(shù)為62個(gè)，正電荷殘基（Arg+Lys）總數(shù)為62個(gè)。蛋白不含有信號(hào)肽，具有一定的親水性，為親水蛋白，無跨膜結(jié)構(gòu)。同源性比較與進(jìn)化樹分析表明，吉爾吉斯白樺WRKY蛋白與大豆和蒺藜苜蓿的WRKY蛋白在進(jìn)化上關(guān)系較近。該基因在0.6%NaHCO3脅迫處理后表達(dá)量增加，為上調(diào)表達(dá)基因。

關(guān)鍵詞吉爾吉斯白樺；WRKY轉(zhuǎn)錄因子；生物信息學(xué)分析

中圖分類號(hào)S188文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2014）23-07703-07

基金項(xiàng)目中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金項(xiàng)目（DL12CA13）；東北林業(yè)大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練項(xiàng)目（201310225101）。

作者簡介田玉富（1991- ），男，寧夏同心人，本科生，專業(yè)：林學(xué)。*通訊作者，碩士研究生，從事植物資源學(xué)領(lǐng)域的研究。

收稿日期20140709在眾多的轉(zhuǎn)錄因子中，WRKY轉(zhuǎn)錄因子是當(dāng)前研究較為廣泛的植物特有的轉(zhuǎn)錄因子，最初是從甜馬鈴薯[1]、野燕麥[2]、歐芹[3]和擬南芥[4]中克隆獲得，由于其蛋白含有高度保守的60個(gè)氨基酸組成的WRKY結(jié)構(gòu)域而將其命名為WRKY轉(zhuǎn)錄因子[5]。WRKY結(jié)構(gòu)域的核心序列靠近氨基（N）末端，由WRKYGQK等7個(gè)保守的氨基酸殘基組成，能夠與基因啟動(dòng)子中的（T）（T）TGAC（C/T）序列（W盒）發(fā)生特異性結(jié)合，從而調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，參與多種與植物生長發(fā)育、脅迫應(yīng)答和物質(zhì)代謝等有關(guān)的重要生理過程；而鋅指結(jié)構(gòu)位于羧基（C）末端。根據(jù)WRKY轉(zhuǎn)錄因子中WRKY結(jié)構(gòu)域的個(gè)數(shù)以及鋅指的類型將其分為3個(gè)大組。1.1試驗(yàn)材料一年生吉爾吉斯白樺（Betula kirghisorum）葉片。

1.2方法

1.2.1BkWRKY1基因的克隆及序列分析。構(gòu)建了0.6% NaHCO3 脅迫下吉爾吉斯白樺葉片組織的轉(zhuǎn)錄組測序文庫，通過對(duì)轉(zhuǎn)錄組文庫隨機(jī)測序，獲得BkWRKY1基因cDNA序列。采用NCBI 的開放讀碼框（ORF founder）尋找軟件（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html），確定該基因的開放讀碼框；采用ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam/）軟件計(jì)算該基因的分子量、等電點(diǎn)、親水性。

1.2.2BkWRKY1蛋白家族、保守區(qū)及二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測。采用pfam27.0（http：//pfam.sanger.ac.uk/）軟件預(yù)測蛋白家族，采用BlastP（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）預(yù)測保守區(qū)，采用SOPMA（http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin /secpred_sopma.pl）預(yù)測BkWRKY1蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.2.3BkWRKY1信號(hào)肽、疏水性及跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測。采用SignalP4.1（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測，采用ProScal（http：//web.expasy.org/protscale/）進(jìn)行蛋白疏水性預(yù)測。用TMHMM程序（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM）對(duì)BkWRKY1進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測。

1.2.4序列相似性分析及進(jìn)化樹的構(gòu)建。采用BlastP尋找相似性序列，并選擇與其相似性高的10種不同植物WRKY蛋白的氨基酸序列，采用ClustalW2（http：//www.ebi.ac.uk/Tools /msa/ clustalw2/）進(jìn)行多序列比對(duì)；同時(shí)用MEGA6軟件構(gòu)建上述11種植物WRKY蛋白的氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.50.6% NaHCO3脅迫處理前后基因表達(dá)量的分析?；虮磉_(dá)量的計(jì)算使用RPKM法[8]，以RPKM值估計(jì)BkWRKY1基因的表達(dá)量，基因表達(dá)量符合FDR≤0.001，且log2Ratio|≥1的基因?yàn)轱@著差異表達(dá)基因。其中，Ratio為脅迫處理后RPKM值與對(duì)照組RPKM值的比值，log2Ratio為0.6%NaHCO3脅迫處理后BkWRKY1基因相對(duì)于對(duì)照組BkWRKY1基因表達(dá)量的變化。

2結(jié)果與分析

2.1吉爾吉斯白樺BkWRKY1基因序列與推斷的氨基酸序列從鹽脅迫后的吉爾吉斯白樺葉片轉(zhuǎn)錄組文庫中測序獲得了BkWRKY1基因的cDNA序列，測序結(jié)果顯示，該基因cDNA包含2 189個(gè)堿基，序列比對(duì)和同源性分析表明，該基因cDNA序列包含1 728 bp的開放閱讀框，編碼575個(gè)氨基酸，5′非翻譯區(qū)（UTR）為119 bp，3′非翻譯區(qū)（UTR）為342 bp。ProtParam 預(yù)測該蛋白的分子量為62.483 kD，理論等電點(diǎn)為7.32，負(fù)電荷殘基（Asp+Glu）總數(shù)為62個(gè)，正電荷殘基（Arg+Lys）總數(shù)是62個(gè)。

2.2蛋白家族、保守區(qū)及二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測對(duì)獲得的基因推導(dǎo)的氨基酸序列用BlastP預(yù)測蛋白保守區(qū)，發(fā)現(xiàn)了WRKY結(jié)構(gòu)域，位于227～285、402～461氨基酸之間含有WRKY蛋白的保守序列，pfam蛋白預(yù)測表明，與其對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)家族WRKY DNA-domain family，以上分析表明該基因?qū)儆赪RKY transcription factor家族。SOPMA軟件預(yù)測結(jié)果表明BkWRKY1蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)以隨機(jī)卷曲為主。注：ATG為起始密碼子；*為終止密碼子。

圖2BkWRKY1基因的cDNA序列及由此推導(dǎo)的氨基酸序列2.3信號(hào)肽、疏水性及跨膜結(jié)構(gòu)分析通過signalp 4.1預(yù)測，該蛋白不含有信號(hào)肽。ProScal蛋白親水、疏水性預(yù)測表），蛋白疏水性最大值：1.789，疏水性最小值：-3.389，疏水平均值為-0.800，具有一定的親水性。并根據(jù)ProtParam軟件預(yù)測Grand average of hydropathicity（GRAVY）：-0.777，所以該蛋白質(zhì)為親水蛋白。TMHMM程序預(yù)測結(jié)果表明，在BkWRKY1長度為575個(gè)氨基酸的蛋白序列中無跨膜結(jié)構(gòu)。

2.4吉爾吉斯白樺等物種BkWRKY1基因的多序列比對(duì)分析用推導(dǎo)的氨基酸序列與蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源性比較，其氨基酸序列與川桑（Morus notabilis，EXB67429.1）、煙草（Theobroma cacao，XP_007020620.1）、蓖麻（Ricinus communis、XP_002529048.1）、甜橙（Citrus sinensis，XP_006474948.1）、草莓（Fragaria vesca，XP_004294460.1）、大豆（Glycine max，XP_003553015.1）、葡萄（Vitis vinifera，XP_002274204.2）、麻風(fēng)樹（Jatropha curcas，AGJ52155.1）、楊樹（Populus trichocarpa，XP_002298853.1）、蒺藜苜蓿（Medicago truncatula，XP_ 003600259.1）等植物WRKY轉(zhuǎn)錄因子的氨基酸序列進(jìn)行兩兩比對(duì)，相似系數(shù)分別為72%、71%、70%、69%、69%、68%、68%、68%、66%、66%，相似性較高。氨基酸序列多重比對(duì)結(jié)果用MEGA6軟件對(duì)該基因及其他物種WRKY轉(zhuǎn)錄因子的氨基酸序列進(jìn)行多序列比對(duì)，繪制分子進(jìn)化樹，進(jìn)化分析結(jié)果表明，吉爾吉斯白樺WRKY蛋白與大豆和蒺藜苜蓿的WRKY蛋白在進(jìn)化上關(guān)系較近。

疏水性分析42卷23期田玉富等吉爾吉斯白樺BkWRKY1基因克隆與序列分析2.50.6% NaHCO3脅迫處理后BkWRKY1基因的表達(dá)量測得BkWRKY1基因?qū)φ战M和脅迫處理后的RPKM值分別為19.803 1和23.622 4，log2Ratio為0.254 4，表明該基因在0.6% NaHCO3脅迫處理后表達(dá)量增加，為上調(diào)表達(dá)基因（圖8）。

3結(jié)論與討論

以白樺轉(zhuǎn)錄組文庫獲得的基因序列為信息來源，從中克隆得到了白樺BkWRKY1基因，屬于WRKY family transcription factor家族，該基因含有2個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域，可編碼575個(gè)氨基酸，對(duì)應(yīng)蛋白的分子量為62.483 kD，理論等電點(diǎn)為7.32，蛋白不含有信號(hào)肽，具有一定的親水性，為親水蛋白，不含有跨膜結(jié)構(gòu)。同源性比較與進(jìn)化樹分析表明，吉爾吉斯白樺WRKY蛋白與大豆和蒺藜苜蓿的WRKY蛋白在進(jìn)化關(guān)系上較近。0.6%NaHCO3脅迫處理后BkWRKY1基因上調(diào)表達(dá)。

WRKY轉(zhuǎn)錄因子在植物界中分布廣泛，目前，發(fā)現(xiàn)辣椒[9]、油菜[10]、玉米[11]、番木瓜[12]、苜蓿[13]、楊樹[14]、蘋果[15]、森林草莓[16]、水稻[17]等多個(gè)種屬植物中均含有WRKY轉(zhuǎn)錄因子。WRKY轉(zhuǎn)錄因子參與植物的多種生理生化與生長發(fā)育過程，在植物應(yīng)對(duì)外界逆境脅迫時(shí)發(fā)揮十分重要的功能。如參與側(cè)根的生長[18-20]，調(diào)控衰老反應(yīng)[21-23]，調(diào)控新陳代謝[24-25]，抑制種子的萌發(fā)[26-29]，調(diào)控非生物脅迫[30-33]，參與生物脅迫[34-49]，參與抗病相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[50-55]。在鹽脅迫條件下，許多植物組織器官中的WRKY基因能夠作出積極的響應(yīng)，上調(diào)或下調(diào)表達(dá)。QIU等[56]研究水稻中13個(gè)WRKY基因，指出其中9個(gè)基因能對(duì)NaCl做出響應(yīng)；研究發(fā)現(xiàn)擬南芥可以忍受150 mmol/L NaCl脅迫，脅迫處理后WRKY17和WRKY33上調(diào)表達(dá)，WRKY17在誘導(dǎo)脅迫6h時(shí)達(dá)最高峰隨后逐漸降低，而WRKY33的豐度在整個(gè)處理過程都保持很高；處理48h時(shí)WRKY25表達(dá)至最高峰，WRKY轉(zhuǎn)錄因子在鹽脅迫反應(yīng)中具有重要作用[57]。150 mmol/L NaCl脅迫下，小麥根中WRKY基因表達(dá)量隨脅迫時(shí)間的延長而逐漸增加；莖中WRKY基因在脅迫1 h時(shí)達(dá)到最大值，而隨脅迫時(shí)間的延長逐漸下降，由此可知對(duì)于鹽脅迫，其根比莖敏感[58]。 珠美海棠幼苗在150 mmol/L NaCl脅迫處理后，MzWRKY19～MzWRKY27等共8個(gè)基因的表達(dá)無明顯變化；葉片中有15個(gè)WRKY基因的表達(dá)受鹽脅迫誘導(dǎo)、1個(gè)基因受鹽脅迫抑制、9個(gè)基因的表達(dá)無明顯變化[59]。200 mmol/L NaCl能強(qiáng)烈誘導(dǎo)MhWRKY40b表達(dá)，且脅迫6h時(shí)基因相對(duì)表達(dá)量達(dá)到最高，說明MhWRKY40b能夠響應(yīng)鹽脅

圖6氨基酸序列的多重比對(duì)圖7白樺等11個(gè)物種的WRKY序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹圖80.6%NaHCO3脅迫處理后BkWRKY1基因的表達(dá)量迫，并有可能在鹽脅迫反應(yīng)中起到了重要調(diào)控作用[60]。

吉爾吉斯白樺BkWRKY1能夠?qū)?.6%NaHCO3脅迫作出上調(diào)表達(dá)的響應(yīng)，但具體的響應(yīng)機(jī)制還不清楚。因此，有待于進(jìn)一步研究鹽脅迫條件下吉爾吉斯白樺BkWRKY1基因及WRKY家族其他成員在抗鹽過程中的功能，為選育抗鹽堿的樺樹品種提供試驗(yàn)依據(jù)。

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