Bcr/abl融合基因在慢性粒細(xì)胞白血病中的檢測(cè)方法及意義

馮術(shù)青　宋旭東

【摘要】bcr/abl 融合基因是慢性粒細(xì)胞白血?。–ML）發(fā)病的分子生物學(xué)基礎(chǔ)，通過靈敏的檢驗(yàn)方法檢測(cè)此基因?qū)ML的診斷、治療和預(yù)測(cè)疾病復(fù)發(fā)等具有重要臨床意義。

【關(guān)鍵詞】 bcr/abl 融合基因；慢性粒細(xì)胞白血病

【中圖分類號(hào)】R733.72 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】B【文章編號(hào)】1004-4949（2014）03-0335-01

慢性粒細(xì)胞白血病（CML）是一種發(fā)生在造血干細(xì)胞的以粒系細(xì)胞慢性增殖為主要特征的惡性克隆性疾病，分子學(xué)水平上形成bcr/abl融合基因。bcr/abl融合基因的表達(dá)水平反映了患者體內(nèi)白血病細(xì)胞的負(fù)荷量。因此，精確檢測(cè)bcr/abl融合基因的表達(dá)水平，對(duì)白血病的臨床分型診斷、個(gè)體化治療方案的制定、治療效果監(jiān)測(cè)、緩解后復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的估計(jì)和預(yù)防、干細(xì)胞移植后殘留細(xì)胞的檢測(cè)和早期干預(yù)治療等方面具有重要的指導(dǎo)作用。本文對(duì)bcr/abl融合基因的檢測(cè)方法及意義進(jìn)行綜述。

1 Bcr/abl融合基因的檢測(cè)方法

1.1 Southern Blot和Western Blot

Southern 印跡即DNA印跡，可以對(duì)bcr/abl融合基因DNA重排進(jìn)行分子生物學(xué)檢測(cè)。Southern Blot可使用從外周血或骨髓細(xì)胞提取的DNA對(duì)bcr/abl融合基因進(jìn)行檢測(cè)，不需要保持細(xì)胞的活力和所處周期，靈敏度約1～5%，多適用于科研而不是臨床診斷[1]。

Western 印跡的原理類似Southern印跡，它是從混合蛋白質(zhì)中區(qū)分并定量分析某種特殊蛋白質(zhì)的重要手段[2-3]。但由于不同蛋白質(zhì)的電轉(zhuǎn)移效率以及單抗的結(jié)合能力不同，Western印跡的敏感性和可重復(fù)性較差，其敏感性為0.5%～1%[4]。另外該法操作繁瑣、檢測(cè)時(shí)間長，限制了其在臨床上的應(yīng)用。

1.2 常規(guī)RT-PCR

1988年RT-PCR被首次應(yīng)用于CML的bcr/abl基因的檢測(cè)[5]。在RT-PCR中，應(yīng)用隨機(jī)引物或abl特異引物，mRNA被反轉(zhuǎn)錄為cDNA，隨后應(yīng)用針對(duì)M-bcr的bl或b2和abl的a2或a3的引物進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物在瓊脂糖或聚內(nèi)烯酰胺凝膠電泳中出現(xiàn)特異的條帶，在典型的CML病例中，b3a2和b2a2擴(kuò)增產(chǎn)物條帶相差75bp。常規(guī)RT-PCR的靈敏度為10-3～10-6。巢式PCR（Nested PCR）通過對(duì)第一輪的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)一步擴(kuò)增，產(chǎn)生片段更短的PCR產(chǎn)物，敏感度提高到10-5～10-7。定性PCR技術(shù)己經(jīng)普遍用于造血干細(xì)胞移植后MRD檢測(cè)。但定性PCR中不可避免地存在著假陽性或假陰性，所以，有必要應(yīng)用定量PCR的方法對(duì)移植后患者進(jìn)行微小殘留病變的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。

1.3 實(shí)時(shí)定量PCR

所謂RQ- PCR技術(shù)是在PCR 反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR 進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。目前國內(nèi)外已發(fā)展了數(shù)種 RQ-PCR 技術(shù)，其中 TaqMan 法簡單易行、特異性好、假陽性低、線性關(guān)系好，整個(gè)過程采用全封閉反應(yīng)管及光電傳導(dǎo)系統(tǒng)，無須顧及污染，亦無須對(duì)樣品進(jìn)行稀釋和電泳，已被應(yīng)用于病原體測(cè)定、腫瘤基因檢測(cè)、基因表達(dá)、突變和多態(tài)性研究等多個(gè)領(lǐng)域[6]。其工作原理是利用Taq 酶的5′→3′核酸外切酶活性。在PCR 反應(yīng)系統(tǒng)中加入一個(gè)熒光標(biāo)記探針，該探針的5′端和3′端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅熒光團(tuán)。當(dāng)探針保持完整時(shí)，淬滅基團(tuán)抑制熒光基團(tuán)的熒光發(fā)射。熒光基團(tuán)一旦與淬滅基團(tuán)發(fā)生分離，抑制作用被解除，熒光基團(tuán)被熒光探測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)到。上述方法利用熒光產(chǎn)生原理，在PCR 過程中可以連續(xù)不斷地檢測(cè)反應(yīng)體系中熒光信號(hào)的變化。所以RQ-PCR實(shí)現(xiàn)了從定性到定量的飛躍，其優(yōu)點(diǎn)分別為：①靈敏度高，可達(dá)10-5，能區(qū)分轉(zhuǎn)錄本2～3倍變化[7]。②可靠、可重復(fù)：利用管家基

因可以對(duì)結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)化，結(jié)果的可重復(fù)性好、可靠。③操作簡便、快速、污染小、安全：可以通過外周血標(biāo)本檢測(cè)，減少了骨髓穿刺創(chuàng)傷且可以處理批量標(biāo)本。整個(gè)PCR和檢測(cè)過程由電腦控制，完整的RQ-PCR分析耗時(shí)不超過60分鐘。擴(kuò)增產(chǎn)物及產(chǎn)物分析在同一個(gè)反應(yīng)體系中完成，不需PCR后處理，杜絕了擴(kuò)增產(chǎn)物污染造成的假陽性。④定量監(jiān)測(cè)：可以動(dòng)態(tài)觀察轉(zhuǎn)錄水平的變化，對(duì)疾病狀態(tài)進(jìn)一步分層，有利于早期療效分析和指導(dǎo)個(gè)體化治療。因此可作為CML治療后監(jiān)測(cè)MRD的有效手段。

2RQ-PCR檢測(cè)bcr/abl融合基因的臨床意義

2.1 CML臨床分型與分期

依據(jù)Ph染色體和bcr/abl融合基因，90%以上慢粒同時(shí)表現(xiàn)為Ph陽性和bcr/abl陽性，在Ph陰性患者中，又有5%左右患者 bcr/abl陽性，稱為Ph陰性和bcr/abl陽性慢粒，其臨床表現(xiàn)、治療反應(yīng)及預(yù)后與Ph和bcr/abl雙陽性慢粒相同。結(jié)合臨床表現(xiàn)、外周血象、骨髓形態(tài)、骨髓病理、染色體、融合基因等檢查，慢粒分為慢性期（CP）、加速期（AP）、急變期（BP）。

2.2 監(jiān)測(cè)分子靶向治療療效

近十年來，隨著以伊馬替尼（IM）為代表的分子靶向藥物酪氨酸激酶抑制劑在CML治療中的應(yīng)用，使干擾素及異基因造血干細(xì)胞移植（allo-HSCT）在成人中的傳統(tǒng)地位受到了挑戰(zhàn)。IRIS研究是迄今為止最大宗報(bào)道IM一線治療CML-CP患者的研究，IRIS 5 年的隨訪結(jié)果表明 OS、EFS 分別為89%、83%[8]，隨訪6 年 OS 及 EFS 分別為 88%、83%[9]，隨訪8 年 OS 及 EFS 分別為 85%、81%[10]。IRIS 試驗(yàn) 7 年的隨訪結(jié)果顯示，治療 12 個(gè)月時(shí) bcr-abl 轉(zhuǎn)錄本水平仍>1%較<1%預(yù)后差，治療 18 個(gè)月獲得與未獲得 MMR 的患者 EFS 分別為 98% vs. 89% （ratio< 0.1%， P= 0.01）[11]。Palandri等[12]的研究水平顯示達(dá)穩(wěn)定 MMR、不穩(wěn)定 MMR（達(dá) MMR 又失去）及從未達(dá) MMR 的患者的在 6 年的中位隨訪時(shí)間內(nèi)失去 CCyR 的可能分別為 4%、21%及 33%。提示早期 bcr/abl轉(zhuǎn)錄本水平下降，且維持穩(wěn)定水平的患者預(yù)后較好。轉(zhuǎn)錄本水平升高，表明 IM 耐藥疾病復(fù)發(fā)，連續(xù)多次監(jiān)測(cè)到bcr/abl轉(zhuǎn)錄本水平連續(xù)升高對(duì)繼發(fā)耐藥的提示意義更大[13]。此時(shí)，應(yīng)盡早轉(zhuǎn)換二代TKI 藥物。轉(zhuǎn)用二線藥物的患者，如果用藥后 3 個(gè)月內(nèi)未取得次佳細(xì)胞遺傳學(xué)緩解，或未取得bcr/abl 轉(zhuǎn)錄本水平小于 10%，或者用藥后 12 個(gè)月內(nèi)未取得主要細(xì)胞遺傳學(xué)反應(yīng)（MCyR 和 CCyR），則預(yù)后不佳，需要考慮移植等其他治療方式[14]。

雖然IM治療CML-CP患者取得了卓著的療效，但仍有一些尚未解決的問題：①不能停藥；②耐藥的存在；③更長期的療效尚待觀察。故依據(jù)我國的國情，中國CML實(shí)踐推薦針對(duì)不同患者，給予TKI、HSCT、干擾素及細(xì)胞毒藥物結(jié)合的個(gè)體化治療[15]。

2.4 監(jiān)測(cè)異基因造血干細(xì)胞移植療效

目前異基因造血干細(xì)胞移植（allo-HSCT）仍是治愈CML的唯一手段，但移植也有可能不能完全清除異常克隆，成為白血病復(fù)發(fā)的根源。慢性期接受移植的CML患者中，約10%～20%復(fù)發(fā)，而在加速期或急變期接受移植的患者復(fù)發(fā)率超過50%。移植后復(fù)發(fā)是移植失敗的主要原因之一，移植后動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)bcr/abl可以預(yù)測(cè)疾病復(fù)發(fā)。北京大學(xué)血液病研究所同胞全相合患者HSCT后3年OS 89.4%，復(fù)發(fā)率2.45%。分析93例單倍體移植治療CML的情況，顯示加速期患者4年DFS達(dá)66.5%，急變期4年DFS為53.8%[15]。這一臨床效果可能與以復(fù)發(fā)危險(xiǎn)度評(píng)估和RQ-PCR連續(xù)監(jiān)測(cè)MRD為基礎(chǔ)的復(fù)發(fā)分層預(yù)防體系最大限度的降低了復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)[16]。許蘭平等[17]認(rèn)為具有以下特點(diǎn)的為HSCT后復(fù)發(fā)低?；颊撸孩僖浦残g(shù)后+1個(gè)月較移植前下降至少2個(gè)對(duì)數(shù)級(jí)以上；②+2至+3個(gè)月持續(xù)下降或在低水平保持穩(wěn)定；③+4至+6個(gè)月降低至測(cè)不出的水平的。此類患者無需給予干預(yù)治療，因此，通過應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR動(dòng)態(tài)檢測(cè)CML患者HSCT后bcr/abl水平有助于篩選出無須進(jìn)行復(fù)發(fā)干預(yù)的患者，可使復(fù)發(fā)干預(yù)更具針對(duì)性，從而提高HSCT總體生存率。國內(nèi)外許多學(xué)者認(rèn)為標(biāo)準(zhǔn)的allo-HSCT后3～5個(gè)月實(shí)時(shí)定量PCR的結(jié)果可以預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)[18]。推薦的分子生物學(xué)復(fù)發(fā)標(biāo)準(zhǔn)為：A：在超過一個(gè)月間隔的連續(xù)三次定量PCR檢測(cè)中bcr-abl/abl>0.02%；或 B：連續(xù)兩次檢測(cè)bcr-abl/abl>0.05%；或 C：bcr-abl/abl 比值在連續(xù) 3 次檢測(cè)中上升，并且在后兩次檢測(cè)中比>0.002% [19]。Olavarria 等[20]用定量 RQ-PCR 研究 138 例 CML 患者 Allo-SCT 后早期的 bcr-abl mRNA 水平，并據(jù)此把患者分為陰性（未檢出）、低水平陽性（bcr-abl 轉(zhuǎn)錄本少于 100/μg RNA 或 bcr-abl/abl 小于 0.02%）和高水平陽性（轉(zhuǎn)錄本水平超過前述標(biāo)準(zhǔn)）三組。結(jié)果移植后 3 年這三組的累積復(fù)發(fā)率分別為 16.7%、42.9%和 86.4%（p=0.0001），而且轉(zhuǎn)錄本水平與復(fù)發(fā)可能性之間的關(guān)系不受供者類別、T細(xì)胞去除與否的影響。Elmaagacli 等[21]應(yīng)用RQ-PCR對(duì)65例CML患者移植后的bcr-abl mRNA進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過中位標(biāo)準(zhǔn)化以后，bcr-abl mRNA 水平在不同病期有顯著性差異；其中，bcr-abl mRNA 水平在 17 例分子學(xué)復(fù)發(fā)為 0.004%；7 例細(xì)胞細(xì)胞遺傳學(xué)復(fù)發(fā)為 0.04%；36 例一直處于穩(wěn)定期為 2.6%；5 例血液學(xué)復(fù)發(fā)為 36%。同時(shí)認(rèn)為，RQ-PCR 法能對(duì)移植后早期復(fù)發(fā)進(jìn)行檢測(cè)，能對(duì)分子學(xué)復(fù)發(fā)與細(xì)胞遺傳學(xué)復(fù)發(fā)進(jìn)行鑒別（p<0.001 ），并進(jìn)行早期干預(yù)治療，如：供者淋巴細(xì)胞輸注（DLI）、停止使用免疫抑制劑、使用干擾素等，可重新獲得分子學(xué)緩解。許蘭平等[22]分析64例行造血干細(xì)胞移植的CML患者，根據(jù)bcr-abl監(jiān)測(cè)結(jié)果，在移植后早期進(jìn)行了干預(yù)治療，方案為免疫調(diào)節(jié)、伊馬替尼單獨(dú)及與免疫調(diào)節(jié)聯(lián)合。結(jié)果伊馬替尼治療組、免疫調(diào)節(jié)治療組、聯(lián)合治療組患者bcr-abl融合基因轉(zhuǎn)陰率分別為86.0%、90.O%和83.9%（p=0.126）；4年累計(jì)白血病血液學(xué)復(fù)發(fā)率分別為32.3%、0和16.1%（p=0.130），單獨(dú)應(yīng)用伊馬替尼組比免疫調(diào)節(jié)治療組復(fù)發(fā)率有增高的趨勢(shì)（P=0.052）；三組患者4年存活率分別為90.O%、89.7和83.O%（P=0.696）。三種治療方案可以達(dá)到相似的療效，但不良反應(yīng)不同，應(yīng)權(quán)衡并進(jìn)行個(gè)性化選擇。

3結(jié)語

實(shí)時(shí)定量PCR是一種快速、準(zhǔn)確、敏感和可靠的實(shí)驗(yàn)方法。使用RQ-PCR的方法能定量動(dòng)態(tài)觀察CML患者bcr/abl基因的轉(zhuǎn)錄水平變化，明顯優(yōu)于RT-PCR等定性的檢查手段。應(yīng)用RQ-PCR方法對(duì)CML異基因造血干細(xì)胞移植后微小殘留病進(jìn)行監(jiān)測(cè)，能在分子生物學(xué)水平上比細(xì)胞遺傳學(xué)更早地預(yù)測(cè)疾病的復(fù)發(fā)，使得在白血病負(fù)荷尚低時(shí)進(jìn)行干預(yù)治療，并且能評(píng)價(jià)干預(yù)的療效，對(duì)疾病獲得良好的結(jié)果有重要的臨床意義。

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