掃描電鏡在嵩草種子結(jié)構(gòu)及發(fā)芽研究中的應(yīng)用

張國(guó)云 何曉華 郭付振

摘要

[目的]為了描述西藏7種嵩草（喜馬拉雅嵩草、大花嵩草、藏北嵩草、短軸嵩草、線葉嵩草、矮生嵩草、高山嵩草）種子的形態(tài)特征，闡明不同種子預(yù)處理方法提高其發(fā)芽率的機(jī)理。[方法]利用掃描電鏡放大倍率大、分辨率高、圖像直觀等特點(diǎn)，在嵩草屬牧草種子結(jié)構(gòu)及種子萌發(fā)研究中引入掃描電鏡，對(duì)青藏高原東部嵩草屬幾種嵩草種子的形態(tài)、解剖特征進(jìn)行了觀察， 并且對(duì)其形態(tài)特征進(jìn)行初步描述。對(duì)7種嵩草種子做了不同濃度的赤霉素、PEG、硫酸、氫氧化鈉化學(xué)處理，對(duì)其果皮特征進(jìn)行了電鏡觀察。結(jié)合發(fā)芽試驗(yàn)，對(duì)嵩草屬牧草種子萌發(fā)率低的原因及不同處理影響嵩草屬植物種子萌發(fā)的機(jī)理進(jìn)行了初步分析。

[結(jié)果]除喜馬拉雅嵩草種子果皮最外層的表皮細(xì)胞細(xì)胞壁較薄、有裂孔外，其他都具有種子小、果皮厚、外表致密、保護(hù)組織機(jī)械性強(qiáng)等特征。不同種子預(yù)處理方法對(duì)果皮的影響不同。赤霉素、PEG對(duì)果皮幾乎無(wú)機(jī)械破壞作用；硫酸對(duì)果皮有一定的破壞作用，但作用有限；氫氧化鈉對(duì)果皮的機(jī)械破壞效果最好。

[結(jié)論]嵩草屬牧草種子在試驗(yàn)條件下萌發(fā)率與其種子的果皮特征關(guān)系密切。嵩草屬牧草種子大多果皮堅(jiān)硬致密、外覆光滑且厚的角質(zhì)層是其萌發(fā)率低的主要原因。一定濃度的氫氧化鈉溶液處理種子能均勻去掉果皮角質(zhì)層，甚至破壞果皮最外層大型厚壁細(xì)胞，增大細(xì)胞間隙，使得中間縱向致密組織變得疏松，讓水分和氧氣易于進(jìn)入種子，從而提高發(fā)芽率。

關(guān)鍵詞掃描電鏡；形態(tài)特征；嵩草屬；萌芽率

中圖分類號(hào)S121文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2014）28-09670-04

Application of SEM in Research of Kobresia Seeds Structures and Germination

ZHANG Guoyun1，HE Xiaohua2，GUO Fuzhen2*

（1.State Key Laboratory of Crop Stress Biology in Arid Areas， Northwest A&F University， Yangling， Shaanxi 712100； 2. Key Laboratory of Plant Protection Resources and Pest Management of Ministry of Education， Entomological Museum， Northwest A&F University， Yangling， Shaanxi， 712100）

Abstract[Objective]The research aimed to describe morphological characteristics of seven kinds of K.obresia （K.royleana，K.macrantha，K.choenoides，K.prattii，K.capillifolia，K.humilis and K.pygmaea）seeds from Tibet and elucidate the mechanisms how different treatments promoted germination percentage.[Method]The structures and germination of Kobresia pasture seeds were studied with the scanning electron microscope for its characteristics of the high magnification， high resolution， and image visual. Seven kinds of Kobresia seeds from Tibet were observed with scanning electron microscope in order to analyze their morphology and anatomy characteristics. Combining the Kobresia pasture seed germination tests， the characteristic of seed peels treated with gibberellin， PEG， sulfuric acid and sodium hydroxide was observed， and the relationship between the low germination rate and the mechanisms of different treatments was preliminarily analyzed. [Result]Except for the cell wall of external seed peels of K.royleana seed was thin with some cracks，the other seeds were small and covered with thick and pykno peels and their protective tissues were very strong.The effects of different treatments on seeds peels were different. GA and PEG almost had no katogene to the peels，and the effect of the sulphuric acid wasnt that good，and the caustic soda had the best effects.[Conclusion]There was a close relationship between the germination rate and the seed skin under the laboratory conditions. It was pointed out that the main reason of the low germinated rates of Kobresia seeds might be that the seed peel was hard， compact， and covered with smooth thick cuticle. With the treatment of certain concentration of sodium hydroxide，the corneous layer of the seeds were abscised uniformly， the sclerenchymatous cells in the outer layers were destroyed， the cell spaces were also increased and even the compact tissues in the middle were loosen， which made the entrance of the water and oxygen into the seeds easily， thereby the germination capacity was improved.

Key wordsScanning electron microscope； Morphology characteristics； Kobresia； Germination percentage

嵩草屬（Kobresia）植物是組成青藏高原高寒地區(qū)植被的主要物種。以該屬一些植物為建群種的嵩草草甸是青藏高原主要的植被類型[1]。嵩草屬牧草是多年生草本植物，草質(zhì)柔軟，營(yíng)養(yǎng)豐富，為各類家畜所喜食，是青藏高原主要的優(yōu)良牧草。其良好生長(zhǎng)對(duì)發(fā)展當(dāng)?shù)亟?jīng)濟(jì)、維持青藏高原地區(qū)的生態(tài)平衡都具有重要作用[2]。然而，由于掠奪式經(jīng)營(yíng)、過(guò)度放牧、鼠蟲(chóng)危害以及人類活動(dòng)的干擾等多種原因，青藏高原草地嚴(yán)重退化，生產(chǎn)力水平不斷下降，生態(tài)環(huán)境也日益惡化[3-7]。目前，對(duì)于嵩草屬（Kobresia）植物資源包括嵩草屬牧草種子及其繁殖特性等方面的研究日益增多[8-16]。針對(duì)嵩草屬牧草種子小、不易觀察等特點(diǎn)，借助于掃描電鏡，筆者先對(duì)采自西藏的幾種嵩草種子的形態(tài)特征及其解剖特征進(jìn)行了觀察與分析，然后對(duì)這幾種嵩草種子做了不同化學(xué)試劑處理，并且對(duì)處理后種子果皮再次進(jìn)行了電鏡觀察。結(jié)合發(fā)芽試驗(yàn)，初步探討了不同處理影響嵩草屬植物種子萌發(fā)的機(jī)理，并且提出了提高嵩草種子發(fā)芽率的方法，以期為西藏地區(qū)的草地植被及生態(tài)恢復(fù)、畜牧業(yè)發(fā)展提供幫助。

1材料與方法

1.1材料

2006年9月上旬，在西藏的那曲、當(dāng)雄和浪卡子3個(gè)不同海拔地區(qū)采集喜馬拉雅嵩草、大花嵩草、藏北嵩草、短軸嵩草、線葉嵩草、矮生嵩草和高山嵩草的種子（表1）作為供試草種。將種子帶回實(shí)驗(yàn)室，自然風(fēng)干后裝入紙袋，室溫貯藏。

1.2 方法

1.2.1

對(duì)供試種子形態(tài)特征、解剖特征及不同處理后種子種皮特征的電鏡觀察。

取上述供試種子及不同化學(xué)試劑處理后種子若干（試劑處理方法見(jiàn)萌發(fā)試驗(yàn)），在解剖鏡下選取一些飽滿種子，部分橫切和縱切，裝入洗凈、貼好標(biāo)簽的青霉素小瓶，用濃度4%、pH 6.8的戊二醛4 ℃固定12 h；再用pH 6.8、濃度0.1 mol/L磷酸緩沖液常溫漂洗5次、每次15 min；濃度30%、50%、70%、80%、90%、95%丙酮脫水1次，時(shí)間20 min；濃度100%丙酮脫水3次，每次30 min；乙酸異戊酯置換2次，每次20 min；然后，用二氧化碳臨界點(diǎn)干燥儀干燥；最后，粘臺(tái)，噴金，用掃描電鏡觀察種皮、胚乳及種子縱、橫斷面結(jié)構(gòu)。

1.2.2

萌發(fā)試驗(yàn)。設(shè)4種試劑處理方式，即將上述7種草種分別用0.15、0.20、0.25、0.30、0.40 g/L赤霉素溶液浸種12、24、36、48 h；體積分?jǐn)?shù)15%、20%、25%、30%聚乙二醇（PEG6000）溶液浸種12、24、36、48 h；體積分?jǐn)?shù)49%、98%硫酸溶液浸種3、5、10 min；10、20、30、40 g/L氫氧化鈉溶液浸種0.5、1.0、2.0、3.0 h。上述處理后的種子都用自來(lái)水反復(fù)沖洗后置于4 ℃冰箱中層積1個(gè)月，以不經(jīng)任何預(yù)處理的種子為對(duì)照，用2PW280B型智能植物培養(yǎng)箱進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)。采用培養(yǎng)皿內(nèi)濾紙上變溫發(fā)芽，每天光照8 h，溫度35 ℃；黑暗16 h，溫度25 ℃。每個(gè)草種每個(gè)處理取100粒種子，3次重復(fù)。逐日觀察，統(tǒng)計(jì)發(fā)芽情況，到第28天結(jié)束試驗(yàn)，測(cè)定發(fā)芽率。

2結(jié)果與分析

2.17種嵩草種子形態(tài)結(jié)構(gòu)特征及解剖特征

結(jié)合掃描電鏡圖像及肉眼觀察，發(fā)現(xiàn)7種嵩草種子的果皮均可分為3層。果皮最外層為大型厚壁細(xì)胞，細(xì)胞腔大而明顯，可儲(chǔ)存大量氣體。表面覆有角質(zhì)層，厚且光滑（喜馬拉雅嵩草除外，果皮最外層表皮細(xì)胞細(xì)胞壁較薄，有裂孔）。中間一層為縱向的機(jī)械組織，排列緊密。最里層為橫向的基本組織。胚位于胚乳之中果柄一側(cè)。不同嵩草種子雖具有以上共性，但也具有不同的結(jié)構(gòu)特征，其種子大小和形狀也有很大差別。

（1）喜馬拉雅嵩草。果實(shí)長(zhǎng)梭形，具有較長(zhǎng)的果柄和果喙，果柄側(cè)保護(hù)組織薄且疏松，厚度僅為17.4 μm（圖1a，1c）。果皮粗糙（圖1b），厚度約55 μm，最外層表皮細(xì)胞外壁有裂孔。

（2）大花嵩草。果實(shí)寬卵形，具有較長(zhǎng)的果柄和果喙，基部（果柄）與頂部（果喙）保護(hù)組織致密層極厚，基部厚度約170 μm（圖1d，1f）。果皮極光滑、致密（圖1e），厚度約58 μm。

（3）藏北嵩草。果實(shí)形似葵花籽，具較長(zhǎng)的果柄和果喙，果喙側(cè)保護(hù)組織厚達(dá)167 μm，基部（果柄）組織疏松，厚度48 μm（圖1g，1i）。果皮細(xì)胞突起、光滑（圖1h），厚度約84 μm。

（4）短軸嵩草。果實(shí)長(zhǎng)圓形，果柄76 μm，果喙180 μm，基部（果柄）組織疏松且薄，厚度25 μm（圖1j，1l）。果皮細(xì)胞突起、致密（圖1k），厚度約32 μm。

（5）線葉嵩草。果實(shí)卵圓形，無(wú)明顯的果柄和果喙，果柄側(cè)致密，保護(hù)組織極厚，約80 μm，果喙側(cè)有導(dǎo)氣孔（圖1m，1o）。果皮細(xì)胞突起，極光滑、致密（圖1n）。果皮厚度約63 μm。

（6）矮生嵩草。果實(shí)側(cè)扁，形似南瓜子，果柄側(cè)與果喙側(cè)致密，保護(hù)組織極厚，基部致密層厚度約75 μm，頂部（果喙）有導(dǎo)氣孔（圖1p，1r）。果皮極光滑、致密（圖1q），厚度約77 μm。

（7）高山嵩草。果實(shí)近三棱形，無(wú)明顯果柄，果喙187 μm。果實(shí)基部與頂部（果喙）致密，保護(hù)組織極厚，約120 μm，頂部（果喙）有導(dǎo)氣孔（圖1s，1u）。果皮細(xì)胞突起，極光滑、致密（圖1t），厚度約88 μm。

2.2不同藥劑處理對(duì)種子表皮的作用（以藏北嵩草為例）

由圖2、3可知，不同藥劑處理對(duì)嵩草種子果皮的影響不同，赤霉素、PEG對(duì)果皮幾乎沒(méi)有機(jī)械破壞作用。由圖4可知，硫酸對(duì)果皮有一定的破壞作用，使得藏北嵩草果皮最外層細(xì)胞出現(xiàn)一些橫向裂孔；由圖5可知，氫氧化鈉對(duì)果皮的機(jī)械破壞效果較好，不但去掉嵩草種子角質(zhì)層，而且使最外層細(xì)胞間隙加大，甚至使部分最外層大型厚壁細(xì)胞脫落。

2.37種嵩草種子的結(jié)構(gòu)特征對(duì)比及不同處理的種子發(fā)芽率

由表2可知，

各嵩草種子未經(jīng)任何處理試驗(yàn)條件下發(fā)芽率與種子大小、地理位置、海拔高度似無(wú)直接關(guān)系，與果皮厚度關(guān)系也不大，但與果皮光滑致密度、發(fā)芽口致密層厚度呈0.05水平顯著負(fù)相關(guān)。赤霉素、PEG處理對(duì)嵩草種子發(fā)芽率沒(méi)有大的影響，一定濃度的硫酸和氫氧化鈉處理能明顯提高發(fā)芽率，其中40%氫氧化鈉處理效果較好，使得上述種子的發(fā)芽率分別由未經(jīng)任何預(yù)處理的91%、0、76%、69%、14%、21%和0提高到96%、90%、93%、96%、74%、63%和50%。

3 結(jié)論與討論

根據(jù)對(duì)7種嵩草種子的形態(tài)和解剖特征以及不同處理后種子種皮特征的觀察與分析，結(jié)合發(fā)芽試驗(yàn)，認(rèn)為嵩草屬牧草種子試驗(yàn)條件下萌發(fā)率與其種子的果皮特征關(guān)系密切。嵩草屬牧草種子果皮大多堅(jiān)硬致密、外覆光滑且厚的角質(zhì)層是其萌發(fā)率低的主要原因。堅(jiān)硬致密的果皮雖有利于嵩草屬種子抵御嚴(yán)寒和外力破壞，也使得胚和胚乳不易獲得足夠的水和氧氣，并且阻礙胚根和胚芽穿破保護(hù)組織，限制種子的萌發(fā)。

從不同處理種子的電鏡照片可以看出，赤霉素、PEG對(duì)果皮幾乎沒(méi)有機(jī)械破壞，對(duì)嵩草屬種子的作用可能更多的是藥理性的，而與對(duì)果皮的機(jī)械破壞無(wú)關(guān)。硫酸對(duì)果皮有一定的破壞作用，使得果皮最外層細(xì)胞破裂，但對(duì)破除角質(zhì)層無(wú)明顯作用。氫氧化鈉對(duì)種皮的機(jī)械破壞效果最好。首先是去角質(zhì)層，使得果皮更容易吸附水分，進(jìn)一步加大細(xì)胞間隙，使細(xì)胞間變得疏松，甚至去掉了果皮最外層的大型厚壁細(xì)胞，使中間縱向致密細(xì)胞層也變得疏松，水分和氧氣易于進(jìn)入種子，從而提高發(fā)芽率。

研究還表明，PEG處理對(duì)上述嵩草種子發(fā)芽率沒(méi)有影響；赤霉素處理對(duì)大花嵩草、藏北嵩草、短軸嵩草、線葉嵩草、矮生嵩草和高山嵩草種子的發(fā)芽率有少許提高；一定濃度的硫酸和氫氧化鈉處理均能明顯提高發(fā)芽率，但以40 g/L氫氧化鈉的處理效果最好。

率的研究中，需要將萌發(fā)試驗(yàn)與不同化學(xué)試劑處理后對(duì)種子種皮的微觀形態(tài)觀測(cè)相結(jié)合，這樣不但有利于找到提高嵩草屬種子發(fā)芽率的方法，而且有利于闡述其機(jī)理。

參考文獻(xiàn)

[1]

張樹(shù)仁.西藏嵩草屬（莎草科）的修訂[J].植物分類學(xué)報(bào)，2004，42（3）：194-221.

[2] 李巧峽，趙慶芳，馬世榮，等.嵩草屬植物研究進(jìn)展[J].西北師范大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，42（6）：78-82.

[3] 武高林，杜國(guó)禎.青藏高原退化高寒草地生態(tài)系統(tǒng)恢復(fù)和可持續(xù)發(fā)展探討[J].自然雜志，2007，29（3）：159-164.

[4] 趙貫鋒，余成群，武俊喜.青藏高原退化高寒草地的恢復(fù)與治理研究進(jìn)展[J].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（5）：125-129.

[5] 王建兵，張德罡，曹廣民，等.青藏高原高寒草甸退化演替的分區(qū)特征[J].草業(yè)學(xué)報(bào)，2013，22（2）：1-10.

[6] 周華坤， 趙新全， 周立，等.青藏高原高寒草甸的植被退化與土壤退化特征研究[J].草業(yè)學(xué)報(bào)，2005，14（3）：31-40.

[7] 賀有龍，周華坤，趙新全，等.青藏高原高寒草地的退化及其恢復(fù)[J].草業(yè)與畜牧，2008（11）：1-9.

[8] 褚希彤，付娟娟，孫永芳.不同海拔梯度嵩草種子的萌發(fā)機(jī)制[J].草業(yè)科學(xué)，2013，30（7）：1025-1030.

[9] 李巧峽，李凱，丁文龍， 等.不同處理對(duì)北方嵩草種子萌發(fā)的影響[J].草業(yè)科學(xué)，2009，26（8）：112-117.

[10] 馬玉玲.三種嵩草種子萌發(fā)技術(shù)的探討試驗(yàn)[J].養(yǎng)殖與飼料，2009（7）：62-63.

[11] 李希來(lái).不同地區(qū)矮嵩草（Kobresia humilis）種子解剖特征和萌發(fā)特性的研究[J].種子，2002（6）：12-13.

[12] 段春華，張德罡，張靖，等.物理、化學(xué)處理方法對(duì)矮生嵩草和線葉嵩草種子萌發(fā)的影響[J].草原與草坪，2013，33（1）：40-44.

[13] 周芝琴，李廷山，胡小文.莎草科4種植物種子休眠與萌發(fā)特性的研究[J].西北植物學(xué)報(bào)，2013，33（9）：1885-1890.

[14] 嚴(yán)虎，茍桂香，王得賢.幾種預(yù)處理對(duì)兩種貯藏期線葉嵩草萌發(fā)的影響[J].青海草業(yè)，2000，9（1）：13-15.

[15] 茍桂香，趙得明.不同處理方法對(duì)三種嵩草種子發(fā)芽率影響的初探[J].青海草業(yè)，2006，15（2）：21-23.

[16] 李希來(lái).非萌發(fā)與萌發(fā)狀態(tài)下兩種嵩草種子解剖特征的初步研究[J].種子，2003（2）：48-50.