金釵石斛多糖對(duì)高糖誘導(dǎo)的大鼠INS—1細(xì)胞胰島素分泌的影響

趙亨 昌智平 張艷磊 唐彥萍

【摘 要】目的：觀察金釵石斛多糖對(duì)高糖誘導(dǎo)的大鼠INS-1細(xì)胞胰島素分泌能力的影響。方法：將大鼠INS-1細(xì)胞分成6組，正常對(duì)照組（NC），高糖作用組（HG），羅格列酮組（ROZ），金釵石斛多糖低（LD）、中（MD）、高（HD）濃度干預(yù)組。各組藥物作用48h后再用高糖作用1h，提取上清分別觀察胰島素分泌情況。用酶促化學(xué)放大發(fā)光法測(cè)定各組上清液的胰島素含量。結(jié)果：與高糖作用組相比，金釵石斛多糖高、中濃度組細(xì)胞的胰島素分泌量明顯增多（P<0.05）。結(jié)論：金釵石斛多糖能增加高糖誘導(dǎo)的INS-1細(xì)胞的胰島素分泌量。

【關(guān)鍵詞】金釵石斛多糖；大鼠；INS-1；胰島素

【中圖分類號(hào)】R587.1 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】1004-7484（2014）04-2456-02

Effect of Dendrobium nobile polysaccharides on insulin secretion by rat INS-1 cells

cultured in high glucose

Zhao heng， Chang zhi-ping， Zhang yanlei，Tang Yan-ping

（Departement of zunyi Medcal College， Gueizhou， Zunyi 563099，China ）

【Abstract】Objective： To observe the effect of Dendrobium nobile polysaccharides on insulin secretion by rat INS-1 cells cultured in high glucose. Methods： We divided into six groups include normal control group （NC）， high glucose control group （HG）， rosiglitazone control group （ROZ）， Dendrobium nobile polysaccharides low dose group （LD）， middle dose group （MD）， high dose group （HD）， and each group was detected by 48hs foster.Then stimulated the cells to secreting insulin by high glucose for 1h， and extracted the supernatant fractions. We measured the insulin levels by chemiluminescence enzyme immunoassay. Results： Dendrobium nobile polysaccharides middle dose and high dose group had higher insulin levels than high glucose control group（P<0.05）. Conclusion： Dendrobium nobile polysaccharides can increase the levels of insulin secreted by rat INS-1 pancreatic cells which cultured in high glucose.

【Keywords】Dendrobium nobile polysaccharides； rat；INS-1； insulin

Ⅰ型糖尿病典型的臨床特征是由于胰島素絕對(duì)或相對(duì)不足所致的高血糖。胰島素是機(jī)體內(nèi)唯一能降低血糖的激素，也是唯一一種同時(shí)促進(jìn)糖原、脂肪、蛋白質(zhì)合成的激素。它是由胰島β細(xì)胞受內(nèi)源性或外源性物質(zhì)如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸、胰高血糖素等的刺激而分泌的。而高血糖會(huì)損害胰島β細(xì)胞，研究 [1，2]表明，高血糖對(duì)胰島β細(xì)胞的損害主要表現(xiàn)在：1、加重胰島素分泌的缺陷和胰島素抵抗（IR）。2、誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞發(fā)生凋亡。當(dāng)β細(xì)胞凋亡或者分泌功能產(chǎn)生缺陷時(shí)，其最直接的表現(xiàn)就是胰島素分泌量的減少。金釵石斛是我國(guó)的傳統(tǒng)名貴中藥，具有延年益壽，抗腫瘤，抗衰老和增強(qiáng)抵抗力等作用。李菲等[3]研究發(fā)現(xiàn)，金釵石斛多糖和生物堿對(duì)腎上腺素性高血糖小鼠有降血糖作用。同時(shí)，本課題組劉圓圓等[4]研究表明，金釵石斛水煎劑對(duì)糖尿病腎病大鼠腎臟起到了保護(hù)作用。由于大量高純度的β細(xì)胞難以獲得，本研究采用大鼠INS-1細(xì)胞予以代替。我們主要采用不同濃度的金釵石斛多糖對(duì)高糖誘導(dǎo)的INS-1細(xì)胞進(jìn)行藥物干預(yù)，觀察其胰島素分泌量的變化，初步判斷金釵石斛多糖的作用效果。

1 材料與方法

1.1 材料

金釵石斛（遵義赤水金釵石斛基地提供）；大鼠胰島素瘤細(xì)胞INS-1（上海博慧斯公司）；RPMI-1640培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco公司）；胎牛血清（美國(guó)Gibco公司）；DEAE Sepharose Fast Flow（美國(guó)GE公司）；馬來(lái)酸羅格列酮（天津葛蘭素史克公司）；IMMULITE ?1000（美國(guó)SIEMENS公司）；胰島素測(cè)定試劑盒（美國(guó)SIEMENS公司）。

1.2 方法

1.2.1 金釵石斛多糖提取

采用本課題組張艷磊等[5]的提取方法，先對(duì)金釵石斛莖進(jìn)行脫脂、水提醇沉，然后用sevag法脫蛋白與透析除去小分子物質(zhì)，最后經(jīng)過(guò)陰離子交換柱進(jìn)行進(jìn)一步純化。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將INS-1細(xì)胞于RPMI-1640培養(yǎng)液（含11.1 mmol/l 葡萄糖，10%FBS，50μmol/l 2-巰基乙醇，1 mmol/l丙酮酸，10 mmol/l HEPES）中，在37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組

實(shí)驗(yàn)分成6組：NC組（含11.1 mmol/l葡萄糖的普通培養(yǎng)液），HG組（含22.2 mmol/l葡萄糖的高糖培養(yǎng)液），ROZ組（高糖培養(yǎng)液+80μmol/l的羅格列酮），LD組（高糖培養(yǎng)液+0.04μg/ml的金釵石斛多糖），MD組（高糖培養(yǎng)液+0.4μg/ml的金釵石斛多糖），HD組（高糖培養(yǎng)液+4μg/ml的金釵石斛多糖）。INS-1細(xì)胞在普通培養(yǎng)液漲到80%～90%時(shí)，加入含0.5%FBS的普通培養(yǎng)液同步化24h。到時(shí)間后，按各分組加入不同的培養(yǎng)液，培養(yǎng)48h。

1.2.4 胰島素分泌量測(cè)定

INS-1在含不同成分的培養(yǎng)液中培養(yǎng)48h后，除去培養(yǎng)瓶中上清。在各培養(yǎng)瓶中重新加入含22.2 mmol/l葡萄糖的高糖培養(yǎng)液，并孵育1h。收集上清液，用酶促化學(xué)放大發(fā)光法測(cè)定胰島素含量，每組重復(fù)3次。

2 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行處理，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ ± s）表示。采用Duncan-t檢驗(yàn)，以P<0.05代表差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 多糖提取結(jié)果

利用DEAE Sepharose Fast Flow分離純化后，得到中性多糖成分，其多糖含量為98.1%，研究認(rèn)為結(jié)果可靠，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)[5]。

3.2 胰島素分泌量測(cè)定結(jié)果

4 討論

糖尿病是高血糖癥、高脂血癥、胰島淀粉樣物質(zhì)的沉積等因素的聯(lián)合作用，使機(jī)體的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定性逐漸破壞，引起各種慢性并發(fā)癥[1]。胰島β細(xì)胞的功能障礙和凋亡與Ⅰ、Ⅱ型糖尿病的發(fā)病都密切相關(guān)[6]，其中一個(gè)直接表現(xiàn)就是胰島素的分泌大量減少。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示，與正常對(duì)照組相比，高糖作用組能顯著抑制胰島素的分泌（P<0.05）。中藥治療糖尿病的機(jī)制包括：抑制α-糖苷酶、胰島素樣作用、修復(fù)β細(xì)胞增加胰島素的分泌、減少胰高血糖素的分泌、提高機(jī)體對(duì)胰島素的敏感性.本研究結(jié)果顯示，與高糖組相比，金釵石斛多糖低、中、高濃度組能在不同程度上增加胰島素的分泌量（P<0.05）。這個(gè)結(jié)果提示，金釵石斛多糖可能在一定程度上能減少高糖作用下β細(xì)胞的凋亡和（或）恢復(fù)其胰島素分泌功能?；蛟S金釵石斛多糖能以此為基礎(chǔ)在一定程度上減輕糖尿病患者的各方面癥狀。雖然這3組不同濃度的金釵石斛多糖在與ROZ組相比時(shí)，效果沒(méi)羅格列酮明顯（P<0.05）。但是，羅格列酮有一定的副作用，陳忻等[7]發(fā)現(xiàn)羅格列酮會(huì)增加65歲以上糖尿病患者患心血管病的風(fēng)險(xiǎn)。而金釵石斛多糖作為一種中藥提取物，目前尚未發(fā)現(xiàn)其對(duì)人體的副作用?？傊?，金釵石斛多糖能夠增加高糖誘導(dǎo)下INS-1細(xì)胞的胰島素分泌，并且無(wú)副作用，在糖尿病治療的研究中應(yīng)對(duì)其多加開發(fā)利用。

近年來(lái)，對(duì)胰島素分泌的研究主要集中在它的幾個(gè)轉(zhuǎn)錄因子上，其中比較重要的有MafA、Pdx1和Beta2[8].這3個(gè)基因共同調(diào)控著胰島素基因的轉(zhuǎn)錄。近來(lái)又有學(xué)者提出，其中的MafA是β細(xì)胞功能完善的關(guān)鍵基因，但具體過(guò)程尚未了解[9]。那么，金釵石斛多糖能否在基因水平上影響β細(xì)胞的胰島素分泌呢？本人對(duì)這方面的研究探索也已開展。繼續(xù)深入的研究，有助于開發(fā)金釵石斛的藥用價(jià)值，并且可能為糖尿病的治療提供新靶點(diǎn)。

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基金項(xiàng)目：

貴州省衛(wèi)生廳科學(xué)技術(shù)基金項(xiàng)目（No：gzwkj2013-1-064）。

通信作者：

唐彥萍（1953-），女，教授，研究方向：藥物分子生物學(xué)，E-mail：tiantian8609445 @163.com