中藥活性成分2， 3—吲哚醌與牛血清蛋白作用研究

許潘健 譚明雄

【摘 要】應用熒光光譜技術， 研究了2， 3-吲哚醌在不同溫度25℃和37 ℃的條件下與牛血清白蛋白（BSA）的結合機制。結果表明，2， 3-吲哚醌能顯著地猝滅BSA的熒光，在25℃時，分子動態(tài)猝滅常數(shù)Ksv為2.1×104Lmol-1s-1；在37 ℃時，Ksv為4.1×104Lmol-1s-1，溫度對ISA與BSA的結合能力有顯著影響， 猝滅機制屬于動態(tài)猝滅。

【關鍵詞】2， 3-吲哚醌；牛血清白蛋白；熒光猝滅

【中圖分類號】O65713 【文獻標識碼】A 【文章編號】1004-7484（2014）04-2434-02

Study on Binding of Active Isatin from Chinese Traditional Medicine with Bovine Serum Albumin

XU Pan-jian1， TAN Ming-xiong2，△

（1. Department of clinical laboratory， Yulin Health School， Yulin， Guangxi， 537000， China； 2. College of Chemistry and Materials， Yulin Normal University， Yulin， Guangxi， 537000， China）

【Abstract】The binding mode between Isatin and bovine serum albumin was studied by Fluorescence Spectroscopy at different temperatures of 25 ℃ and 37 ℃. It is showed that Isatin can significantly quench the fluorescence of BSA. The dynamic quenching constant， Ksv， is 2.1×104Lmol-1s-1 at 25 ℃， and 4.1×104 Lmol-1s-1 at 37 ℃. The temperature has a significant effect on the binding capacity of Isatin bound to Bovine Serum Albumin. The mechanism is a dynamic quenching.

【Key words】Isatin； Bovine serum albumin； Fluorescence quenching

血清白蛋白（SA）是血漿中的主要蛋白質(zhì)，是許多藥物轉(zhuǎn)運和分布的載體，中藥小分子與血清白蛋白的結合機制研究一直以來引起人們的廣泛興趣，牛血清白蛋白（BSA）一直被廣泛研究，部分原因是由于其結構與人血清白蛋白（HSA）的高序列同源性[1-4]。 2， 3-吲哚醌，又名靛紅（isatin，ISA），是我國傳統(tǒng)抗癌中藥青黛和大青葉中的活性成分，具有抗癌作用[5]， 可以調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細胞生長因子， 對動脈粥樣硬化調(diào)血脂作用[6-7]。 本文通過熒光光譜技術，研究ISA與BSA的結合機制，通過對熒光特征峰及其在不同條件下的位移情況、熒光猝滅等的研究，可以獲得蛋白質(zhì)分子中熒光生色基團結構和所處微環(huán)境及其分布情況等有用信息， 同時還可以得到外源物質(zhì)與生物大分子相互作用的有關數(shù)據(jù)，對于闡明ISA在體內(nèi)的運輸過程及揭示其抗癌機理具有十分重要的意義。

1 材料與方法

1.1試劑與儀器

BSA為Sigma公司產(chǎn)品（產(chǎn)品批號A70030），其它所用試劑均為國產(chǎn)分析純試劑，實驗用水為二次去離子水。

TU-1901型紫外可見分光光度計（北京普析儀器有限公司），F(xiàn)-2500型熒光分光光度計（日本島津公司）， PHS-3C型精密酸度計（上海雷磁儀器廠）

1.2實驗方法

以pH=7.35的Tris-HCl-NaCl緩沖溶液（含100 mmol/L的NaCl以維持溶液的離子強度），配制濃度為1×10-5 mol/L的BSA溶液， 3×10-4 mol/L的ISA溶液，在4°C的條件下冷藏備用。

熒光光譜的測定：移取2 mL濃度為1×10-5 mol/L的BSA溶液，于1 cm的石英比色皿中，用微量注射器逐漸向該溶液加入濃度為3×10-4 mol/L的ISA溶液進行滴定，以280 nm為激發(fā)波長，發(fā)射狹縫寬度均為5.0 nm，分別測量25 ℃、37 ℃溫度下BSA在波長為300～600 nm的熒光光譜。

2 結果

2.1 ISA對BSA熒光的猝滅作用

在溫度25℃和37℃條件下，研究ISA與BSA的相互作用，如圖1所示。從圖中可以看出，BSA在波長為378nm處有強烈的熒光發(fā)射峰， 隨著ISA濃度的增加而逐漸呈下降的趨勢， 但發(fā)射峰的位置和形狀不變，表明ISA與BSA發(fā)生了相互作用，在作用過程中ISA能顯著地猝滅BSA的熒光[8-9]。

圖1 ISA對BSA熒光的猝滅曲線

2.2 熒光猝滅機制分析

熒光猝滅作用，按其猝滅機制的不同可以分為靜態(tài)猝滅和動態(tài)猝滅， 靜態(tài)猝滅是指猝滅劑與熒光體之間形成了新的復合物，而動態(tài)猝滅是指猝滅劑與熒光體的激發(fā)態(tài)分子之間的相互作用引起的，其過程遵循Stern-Volmer方程[10]

（1）

式中F0和F分別表示不加入和加入猝滅劑時體系的熒光強度，Kq為雙分子猝滅過程速率常數(shù)，τ0為未加入猝滅劑時熒光分子的平均壽命，分子熒光壽命約為1×10-8s[11]，Ksv為動態(tài)猝滅常數(shù)，[Q]為猝滅劑的濃度。假設吲哚醌對BSA的熒光猝滅過程為動態(tài)猝滅過程，以F0/F對相應的[Q]作圖， Stern-Volmer曲線如圖2所示，對所得的曲線圖進行線性擬合，求得25℃和37℃時的猝滅常數(shù)Ksv及Kq，如表1所示。

對于動態(tài)猝滅，Ksv隨溫度的升高而增大，而對于靜態(tài)猝滅，Ksv隨溫度的升高而降低，一般猝滅劑對大分子動態(tài)猝滅的最大擴散猝滅常數(shù)為2.0×1010（L/moL·s）[11]。由表中計算的結果可知，在298 K時，分子動態(tài)猝滅常數(shù)Ksv為2.1×104Lmol-1s-1；在310 K時，Ksv為4.1×104Lmol-1s-1。在298 K時，雙分子猝滅過程速率常數(shù)Kq為2.1×1012Lmol-1s-1；在310 K時，Ksv為4.1×1012Lmol-1s-1，在這兩個溫度的Kq>2.0×1010（L/mol·s），表明ISA和BSA之間形成沒有形成復合物，發(fā)生的是動態(tài)猝滅。

2.3 ISA和BSA結合的結合常數(shù)和結合位點數(shù)

當小分子在大分子上有n個相同且獨立的結合位點數(shù)時，則小分子與生物大分子的結合平衡方程 [12-13]。

（2）

其中K為結合常數(shù)，n為結合位點數(shù)。以log[（F0-F）/F]對log [Q]作圖，如圖3所示，在25℃和37℃條件下的結合常數(shù)K和結合位點數(shù)n的值列于表2。

從表中可以看出，ISA與BSA之間存在較強的作用力，在37℃時，結合常數(shù)及結合點位數(shù)大于25℃，說明溫度影響ISA與BSA的作用能力，溫度的提高對藥物在血漿中儲留的時間縮短，增加了其最大的作用強度。

3 結論

2，3-吲哚醌（ISA）是我國傳統(tǒng)抗癌中藥青黛和大青葉中的活性成分，采用熒光光譜法，在不同生理溫度25℃和37 ℃，pH=7.35的條件下 ISA與BSA發(fā)生了相互作用，能顯著地猝滅BSA的熒光，屬于動態(tài)猝滅。在37℃時，結合常數(shù)及結合點位數(shù)大于25℃，說明溫度影響ISA與BSA的結合能力，溫度升高使藥物在血漿中儲留的時間縮短，增加了其最大的利用強度。

研究藥物與蛋白質(zhì)的相互作用在藥學、藥理學、生物化學上均有重要的意義。本研究可以為藥物與BSA在生理上的相互作用提供重要的實驗數(shù)據(jù)，并為環(huán)境對BSA構象的影響提供了在相關生理活動方面的有用信息。

參考文獻：

[1] Y.Q. Wang， H.M. Zhang， G.C. Zhang， et al. Spectroscopic studies on the interaction between silicotungstic acid and bovine serum albumin[J]. J. Pharm. Biomed. Anal.， 2007，43 ：1869-1875.

[2] N. Zhou， Y.Z. Liang， P. Wang. 18b-Glycyrrhetinic acid interaction with bovine serum albumin[J]. J. Photochem. Photobiol. A， 2007， 185： 271-276.

[3] C. Bertucci， S. Cimitan， A. Riva， et al. Binding studies of taxanes to human serum albumin by bioaffinity chromatography and circular dichroism[J]. J. Pharm. Biomed. Anal.， 2006， 42： 81-87.

[4] Y.J. Hu， Y. Liu， R.M. Zhao， et al. Spectroscopic studies on the interaction between methylene blue and bovine serum albumin[J]. J. Photochem. Photobiol. A， 2006，179： 324-329.

[5]王蕾， 曹靜， 鞠傳霞， 等. 2， 3-吲哚醌抗腫瘤作用研究[J].中國藥理學通報， 2007， 23（ 8）： 1052-1056.

[6] 劉占濤， 楊志宏， 趙永娟， 等. 2， 3-吲哚醌對實驗性動脈粥樣硬化調(diào)血脂作用的研究[J]. 中國藥理學通報， 2006， 22（ 10）： 1279-1280.

[7] 鞠傳霞，侯琳，孫福生， 等. 2， 3- 吲哚醌對血管內(nèi)皮細胞生長因子的影響及作用機制研究[J].中國藥房，2006，17 （24）： 1851-1853.

[8] C.Q. Jiang， T. Wang.Study of the interactions between tetracycline analogues and lysozyme[J]. Bioorg. Med. Chem.， 2004，12： 2043-2047.

[9] Y.J. Hu， Y. Liu， J.B. Wang， X.H. et al. Qu， Study of the interaction between monoammonium glycyrrhizinate and bovine serum albumin[J]. J. Pharm. Biomed. Anal.， 2004， 36： 915-919.

[10] T.G. Dewey （Ed.）， Biophysical and Biochemical Aspects of Fluorescence Spectroscopy[J]. Plenum Press， New York， 1991， pp. 1-41.

[11] W.R. Ware. Oxygen quenching of fluorescence in solution： an experimental study of the diffusion process[J]. J. Phys. Chem.， 1962， 66 ： 455-458.

[12] M.X. Xie， X.Y. Xu， Y.D. Wang.Interaction between hesperetin and human serum albumin revealed by spectroscopic methods[J]. Biochim. Biophys. Acta ， 2005，17（24）： 215-224.

[13] U. Kragh-Hansen. Molecular aspect of ligand binding to serum albumin[J]. Pharmacol. Rev.， 1981，33： 17-53.

*基金項目：

國家自然科學基金（項目編號：21261025）， 廣西自然科學基金項目 （項目編號：013064）

△通訊作者