豬圓環(huán)病毒2型、豬繁殖與呼吸綜合征病毒和豬瘟病毒混合感染的多重PCR診斷

王偉丞，曾智勇,2*，湯德元，劉 釗（.貴州大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025；2. 貴州省動(dòng)物疫病研究室，貴州 貴陽 550025）

豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)感染是世界范圍內(nèi)一種重要的豬傳染病，該病于1991年在加拿大首次被發(fā)現(xiàn)，目前已呈世界性流行。我國許多地方都報(bào)道有該病的流行，且常與其他病毒混合感染，給養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的損失[1]。豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染引起的母豬繁殖障礙和各年齡段豬呼吸系統(tǒng)障礙為特征的傳染病[2]，1996年首次證實(shí)我國存在PRRS，至今已流行于我國大部分地區(qū)，且常呈暴發(fā)式流行。特別是2006年發(fā)生的“豬高熱病”，據(jù)相關(guān)研究表明，PRRSV的NSP2基因發(fā)生部分缺失，致病性增強(qiáng)，高致病性豬藍(lán)耳病給養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展帶來了重創(chuàng)[3]。豬瘟（CSF）是由豬瘟病毒引起的一種高致死性烈性傳染病，我國雖然有免疫效果較好的豬瘟兔化弱毒疫苗，但是免疫失敗的事例時(shí)有發(fā)生，其原因可能是目前流行的豬瘟病毒發(fā)生變異導(dǎo)致與豬瘟疫苗毒株抗原性不一致，使得疫苗的保護(hù)力降低[4]。2013年8月，安順地區(qū)某豬場發(fā)生一起以仔豬腹瀉、保育豬呼吸困難、母豬流產(chǎn)為特征的疾病，使用抗生素?zé)o效，發(fā)病率和死亡率較高。該豬場于2013年9月送檢1頭病死仔豬以確診病毒感染情況，本試驗(yàn)選用豬繁殖障礙性病毒性疫病6重PCR檢測方法[5]，對該病料進(jìn)行了PRV、PPV、PCV2、PRRSV、CSFV和JEV感染情況的快速診斷?，F(xiàn)將診斷過程報(bào)道如下：

1 材料與方法

1.1 病料

貴州省安順市某豬場送檢1頭60日齡病豬。

1.2 參考序列與主要試劑

根據(jù)美國國立生物技術(shù)信息中心（NCBI） 公 布PRVgE（NC-006151）、PPVNS1（NC-001718）、P C V 2O R F 2(N C-0 0 5 1 4 8）、PRR SVOR F 5(N C-001961)、CSFVE2（X 87939）、JEVE(M 55506)序列設(shè)計(jì)多重PCR引物；核酸提取試 劑 盒；Prim eScriptOneStepRTPCRK itVer.2.0。

圖1 病料多重PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果

1.3 引物的設(shè)計(jì)與合成

設(shè)計(jì)了檢測PRV、PPV、PCV 2、PRRSV、CSFV和JEV的6對引物，預(yù)期的擴(kuò)增目的片段長度為178bp、271bp、353bp、433bp、508bp和1015bp。引物送上海生物工程有限公司合成。

1.4 病料處理

采集送檢病豬肺臟、脾臟、腎臟和淋巴結(jié)等組織置于乳缽剪碎后用PBS按1∶5倍稀釋研磨，制成乳懸液，-80℃反復(fù)凍融3次，8000r/m in離心15m in，取上清于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 病料中DNA/RNA的抽提

嚴(yán)格按寶生物工程（大連）有限公司（TaKaRa）核酸提取試劑盒說明書提取病料中的核酸。

1.6 多重PCR反應(yīng)

以病料核酸為模版進(jìn)行多重PCR擴(kuò) 增。 反 應(yīng) 體 系 為50μL，2×oneStepBu ffer25μL， 核 酸模 版5μL，Prim eScrip toneStepEnzymeM ix2μL，上下游引物各1μL， 共 6對 引 物，RNaseFreeH2O6μL。反應(yīng)條件：50℃40m in；94℃5m in；94℃30s，57℃30s，72℃30s，35個(gè)循環(huán)；72℃10m in。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 流行特點(diǎn)和臨診癥狀

貴州省安順市某豬場存欄豬1500頭左右，其中母豬130頭。2013年8月該豬場突然出現(xiàn)以妊娠母豬流產(chǎn)、早產(chǎn)、產(chǎn)死胎，育肥豬進(jìn)行性消瘦、呼吸困難和仔豬高死亡率為特征的疾病，發(fā)病率在50%左右，仔豬病死率高達(dá)80%。發(fā)病后曾用強(qiáng)力霉素治療，效果不佳，該豬場已免疫豬瘟和豬繁殖與呼吸綜合征疫苗，未免疫豬圓環(huán)病毒疫苗。

2.2 解剖病理變化

剖檢可見病豬全身淋巴結(jié)腫大出血，特別是腹股溝淋巴結(jié)，呈紅黑色外觀；腎臟有針尖狀出血點(diǎn)且色澤變淡；脾臟腫大呈紫黑色；肺呈彌漫性間質(zhì)性肺炎，其他病變不明顯。

2.3 PCR擴(kuò)增結(jié)果

應(yīng)用已建立的6重PCR檢測技術(shù)，對送檢病料進(jìn)行快速檢測，擴(kuò)增出了353bp、433bp和508bp左右大小的特異性條帶，結(jié)果表明，該病死仔豬感染有PCV2、PRRSV和CSFV。（圖1）

3 討論

從發(fā)病情況、臨床癥狀、剖檢變化及實(shí)驗(yàn)室診斷，確診該豬場感染有PCV2、PRRSV和CSFV。

該場盡管免疫了PRRSV和CSFV疫苗，但送檢仔豬仍出現(xiàn)PCV2、PRRSV和CSFV的三重感染，筆者認(rèn)為可能系該豬場因未免疫PCV2疫苗，導(dǎo)致仔豬群感染PCV2野毒。由于PCV 2具有免疫抑制作用，會(huì)造成豬免疫系統(tǒng)損傷，導(dǎo)致PRRSV和CSFV疫苗免疫效果不佳，甚至免疫失敗，進(jìn)而因多重感染導(dǎo)致仔豬的大量死亡。單一的PCV2或PRRSV感染對豬機(jī)體的毒力較弱，但當(dāng)它們發(fā)生混合感染或與其他病原混合感染時(shí)會(huì)導(dǎo)致死亡率升高，危害較大[6]。2010年，潘艷[7]報(bào)道，在PCV2陽性豬場，接種CSFV疫苗后，大大降低該疫苗的效果，甚至導(dǎo)致無抗體產(chǎn)生，容易引發(fā)CSFV的暴發(fā)，所以在養(yǎng)豬生產(chǎn)中，一定要對PCV2進(jìn)行檢測，確診PCV2陽性的豬場，要對CSFV疫苗免疫豬進(jìn)行其抗體的動(dòng)態(tài)監(jiān)測，不能因接種CSFV疫苗就忽視對豬瘟的防疫。

由于豬群中PCV2感染較為普遍，但真正發(fā)病的或表現(xiàn)出臨床癥狀的較少，加之PCV 2商品化疫苗的價(jià)格較高，因此很多養(yǎng)殖戶對PCV2的疫苗免疫不夠重視，從而導(dǎo)致豬群容易免疫抑制。應(yīng)用PCV2疫苗免疫是預(yù)防該病毒感染的主要手段之一，劉長明[8]研究表明，疫苗接種豬群與空白對照組對比，主動(dòng)免疫仔豬發(fā)病率可下降15.1%，死淘率可下降3.6%；免疫母豬后結(jié)果顯示，仔豬獲得被動(dòng)免疫出生時(shí)死胎率下降了2.3%，初生仔豬成活率提高了7.6%，斷奶時(shí)成活率提高了7.5%，且豬群藥物保健費(fèi)用明顯下降、飼料轉(zhuǎn)化率提高。因此豬場對于PCV2感染的防控，接種PCV2疫苗是非常重要的。

本試驗(yàn)從1頭仔豬病料中同時(shí)檢測出PCV2、PRRSV和CSFV，可知現(xiàn)在的豬場感染越來越復(fù)雜，由此給疾病的診斷和防控工作帶來新的挑戰(zhàn)，在診斷和預(yù)防上都應(yīng)綜合考慮，特建議豬場在進(jìn)行疫苗免疫前后，均須對相關(guān)疫病抗體進(jìn)行檢測，以確定野毒感染情況及疫苗免疫效果，及時(shí)調(diào)整免疫程序。

[1]郎洪武，陳曉春，吳華偉，等.豬圓環(huán)病毒病及其生物制品學(xué)的研究進(jìn)展[J].中國獸醫(yī)科學(xué),2012(5):545-550.

[2]代軍，任志華，鄧俊良，等.豬繁殖與呼吸綜合征研究進(jìn)展[J].黑龍江畜牧獸醫(yī),2013(7):28-31.

[3]吳錦艷，田宏，尚佑軍，等.高致病性豬藍(lán)耳病病毒GS/LZh/07株的分離、鑒定及其非結(jié)構(gòu)蛋白Nsp2基因特性分析[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào),2009，40(3):438-443.

[4]郝飛，湯德元，曾智勇，等.我國豬瘟病毒基因流行變異研究[J].中國豬業(yè),2013(2):42-44.

[5]劉志杰，曾智勇，湯德元，等.豬繁殖障礙病毒性疫病六重PCR檢測方法的建立及應(yīng)用[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào),2012(9):1429-1436.

[6]溫永俊，吳國軍，蔡雪輝，等.豬圓環(huán)病毒和豬繁殖與呼吸綜合征病毒混合感染對仔豬致病性的評估[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào),2007(5):336-340.

[7]潘艷，李軍，禤雄標(biāo)，等.豬瘟疫苗在豬圓環(huán)病毒2型陽性豬場的免疫效果觀察[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2010,31(11):23-26.

[8]劉長明，危艷武，陸月華，等.豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗(LG株)的研制與應(yīng)用[J].畜牧獸醫(yī)科技信息,2010(9):29-30.