結腸癌干細胞的篩選及其耐藥性研究

韓文遒

【摘要】結腸癌干細胞是一小部分存在于結腸癌中具有自我更新、無限增殖和多項分化潛能的腫瘤干細胞。許多研究已證實在包括結腸癌在內的多種實體瘤中存在腫瘤干細胞，它與結腸癌的復發(fā)、轉移和治療耐受有著密切的聯(lián)系。雖然癌干細胞在腫瘤細胞總數(shù)中只占很小比例，但是在腫瘤的起源、發(fā)展、轉移以及復發(fā)等方面均有重要的作用。本研究對結腸腫瘤干細胞的篩選及耐藥性進行了探討。

【關鍵詞】腫瘤干細胞；篩選；耐藥性

【中圖分類號】R739.4 【文獻標識碼】B【文章編號】1004-4949（2014）03-0141-02

1結腸癌干細胞的篩選

1.1篩選方法

腫瘤干細胞是腫瘤研究中的一大難題，其中最困難的是如何從腫瘤組織中分離出腫瘤干細胞。目前，分離和純化腫瘤干細胞的方法主要有三種，但各有各的優(yōu)缺點。一是無血清培養(yǎng)形成細胞球，亦是富集腫瘤干細胞的方熒；二是熒光染料法，但此種方法有一定的局限性；三是表面標志分子篩選法，又可分為流式細胞儀分選法和免疫磁珠分選法。這兩種方法均利用腫瘤干細胞表面特異的標志分子與帶有標志的抗體結合，從而使其與非腫瘤干細胞分離。

1.2篩選過程

采用干細胞球培養(yǎng)法篩選結腸癌干細胞時，要取生長狀態(tài)良好的結腸癌細胞制成單細胞懸液并計數(shù)，取單個細胞放入腫瘤干細胞培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)，每天晃動幾次，防止細胞貼壁，待細胞球變大，亮度降低，結構變松散時用酶消化傳代，取親本及傳代后細胞放入孔板中培養(yǎng)后，計算成球率。取生長狀態(tài)良好的結腸癌干細胞球置于含有牛血清的中培養(yǎng)，觀察細胞貼壁分化情況進行磁珠分選。磁珠分選后，采用流式細胞術檢測分選后細胞中含有表面抗原分子細胞含量。為了檢測結腸癌細胞形成的癌細胞克隆球的抗原分子蛋白表達情況，接種后第6天克隆細胞球被采用免疫熒光檢測。將分選后的細胞分別接種于無血清培養(yǎng)基中，檢測標記細胞的體外增殖能力。

1.3標志分子的功能及其在結腸癌干細胞篩選中的應用

篩選結腸癌干細胞的標志分子大部分根據(jù)其表達水平而定，但標志分子在腫瘤干細胞中的功能尚不清楚。盡管結腸癌一直被認為起源于腫瘤干細胞，但因缺乏可靠的生物學標記，直到最近這個假說才得以證實。表面抗原分子是第一個用于篩選結腸癌干細胞的表面標志分子，是維持腫瘤干細胞干性的重要分子。以表面抗原分子篩選所得到的結腸癌細胞經鑒定具有體內成瘤能力，然而有研究發(fā)現(xiàn)表面抗原分子和轉移后的結腸癌細胞都具有體內成瘤能力，這使利用表面抗原分子篩選結腸癌干細胞令人質疑。因此，利用表面抗原分子來篩選腫瘤干細胞需進一步的驗證。跨膜糖蛋白是另一個在腫瘤中運用廣泛的篩選腫瘤干細胞的標志分子，也是第一個應用于判斷腫瘤放射治療療效的干細胞標志分子根據(jù)跨膜糖蛋白的表達來判斷腫瘤組織中腫瘤干細胞的密度，從而就能達到預測放射治療的效果。研究發(fā)現(xiàn)腫瘤干細胞標志分子在誘導與維持細胞與基質之間的鏈接起著重要作用，同時也能增強腫瘤細胞在新環(huán)境的增殖能力。

2結腸癌干細胞的耐藥性研究

2.1引起腫瘤干細胞產生耐藥性的原因

惡性腫瘤的治療方法主要有手術、化療和放療。其中化療是最主要的治療手段。但由于腫瘤干細胞可以產生耐藥性，使得腫瘤可以對多種化療藥物產生耐受，最終導致化療失敗。導致腫瘤干細胞產生耐藥性的主要原因有以下幾點。一是高表達轉運蛋白可以參與多種跨膜轉運過程，將糖類、脂類、氨基酸及細胞毒性藥物等大分子物質逆濃度梯度轉運到細胞外；二是腫瘤干細胞通常很少處于細胞生長的增殖期，當其收到一定刺激時會重新進入有絲分裂期，造成腫瘤復發(fā)；三是臨床上常用的化療藥物的作用機制之一是誘導細胞凋亡，而腫瘤干細胞內細胞凋亡受到抑制，對這類化療藥物不敏感；另外，化療藥物的作用靶點通常是DNA，而腫瘤干細胞內的多種酶可以促進DNA的損壞修復功能，使腫瘤干細胞無法收到這類藥物的作用。

2.2腫瘤干細胞的耐藥性實驗及結論

可靠的腫瘤干細胞篩選將為腫瘤干細胞干性及分化信號通路調節(jié)機制研究奠定基礎。經實驗證實，結癌干細胞對傳統(tǒng)化學治療藥物比一般的腫瘤細胞具有更強的耐受性。處于靜止期或慢周期狀態(tài)是成體干細胞的一個重要特點，研究表明腫瘤干細胞也大多處于靜止狀態(tài)，并參與了腫瘤的耐藥、復發(fā)和轉移。細胞周期檢測發(fā)現(xiàn)干細胞中處于靜止期的細胞要明顯多于親本細胞，一方面表明腫瘤干細胞與成體干細胞的相似性，另一方面也進一步解釋了腫瘤干細胞對細胞周期特異性藥物的耐藥性。實驗結果還顯示了結腸癌干細胞富集與耐藥的相關性。干細胞球細胞對不同藥物的耐藥性均明顯高于親本細胞，其中細胞處于靜止期使細胞對藥物周期特異性的耐藥，而表達升高使細胞對不同種藥物均耐受，表現(xiàn)出多藥耐藥性。結腸癌治療多年后復發(fā)及遠處轉移都與殘留的結腸癌干細胞有關。因此，腫瘤干細胞靶向治療具有重要的研究前景。

2.3腫瘤干細胞的靶向治療

目前腫瘤干細胞靶向治療的原理就是利用其表面表達的標志分子開展的。通過組織芯片發(fā)現(xiàn)這種標志分子抗原在不同臨床病理分期的結腸癌中均有表達。這表明碳末端抗原表位可作為潛在的分子靶點，而化療藥物就可特異性結合到這個靶點，繼而靶向治療結腸癌。在臨床結腸癌的治療方面，一些研究者發(fā)現(xiàn)細胞膜表面表達的膜蛋白可以作為直接靶向目標或間接介導凋亡誘導復合物的內部分化而殺死腫瘤細胞。目前結腸干細胞的表面標志仍然不明確，因此，是否存在其他亞群的結腸癌干細胞仍是科學研究的方向。隨著研究的進一步深入，可能會出現(xiàn)更多結腸癌干細胞表面標記，使得更為精細和科學的結腸癌干細胞的分離、鑒定成為可能。

3結語

干細胞標志分子在結腸癌干細胞研究中的作用是不容置疑的，但是目前對腫瘤干細胞生物學特性的功能仍不清楚。由于結腸癌干細胞迄今缺乏高特異性生物標記，生物學特性復雜，要開展靶向治療還有待探索。對結腸癌干細胞的深入研究，有可能會從全新的角度去闡明結腸癌發(fā)生、發(fā)展的機制，從而為結腸癌的診斷、治療提供一種新的思路，具有無限的發(fā)展空間和深遠的科學意義。

參考文獻

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