天七方對(duì)H2O2誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷的抗氧化作用研究

劉松濤等

【摘要】目的：研究天七方（TQ）對(duì)H2O2所致心肌細(xì)胞損傷的抗氧化作用。方法：建立H2O2誘導(dǎo)的心肌損傷模型，通過(guò)MTT法觀察在不同濃度天七方的干預(yù)下，對(duì)心肌細(xì)胞增殖作用的影響，采用試劑盒法檢測(cè)丙二醛（MDA）含量，超氧化物歧化（SOD），谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）和過(guò)氧化氫酶（CAT）活力。結(jié)果：天七方可明顯抑制H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞的凋亡，降低MDA水平，提高SOD，GSH-Px和CAT的活力。結(jié)論：天七方通過(guò)提高抗氧化酶的活力，抑制H2O2所致的心肌細(xì)胞的氧化損傷。

【關(guān)鍵詞】天七方；心肌損傷；氧化應(yīng)激

【中圖分類(lèi)號(hào)】 Q554 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】B【文章編號(hào)】1004-4949（2014）03-0077-01

隨著人們生活水平的不斷提高，人口平均壽命的延長(zhǎng)，缺血性心臟病（又稱(chēng)冠心病，coronary artery disease，CAD）的發(fā)病率不斷上升，已經(jīng)成為當(dāng)今世界威脅人類(lèi)健康的主要疾病之一。越來(lái)越多的研究顯示，氧化應(yīng)激在缺血性心臟病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中扮演了重要的角色，是引起心肌細(xì)胞凋亡的主要影響因素之一[1]。氧化應(yīng)激是指活性氧自由基的產(chǎn)生超過(guò)了機(jī)體內(nèi)的清除和/或使用能力，而導(dǎo)致活性氧自由基及其相關(guān)代謝產(chǎn)物在體內(nèi)的過(guò)量聚集，從而對(duì)機(jī)體造成多種損害作用的病理狀態(tài)[2]。

中藥復(fù)方天七方由紅景天，三七，柴胡和太子參組成，是黑龍江省著名老中醫(yī)劉勤教授運(yùn)用中醫(yī)理論，結(jié)合幾十年的臨床經(jīng)驗(yàn)精心研制并總結(jié)出的治療冠心病，心肌缺血的經(jīng)驗(yàn)方。本文從分子水平深入闡明天七方抗心肌缺血的作用機(jī)制，為其臨床的應(yīng)用和推廣提供堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物 SPF級(jí)SD♂乳鼠（24 h），由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供。

1.2藥物 紅景天、三七、柴胡和太子參，各藥物加水浸泡30 min，先加藥量8倍的水，沸騰后煎40 min，過(guò)濾取汁，再加8倍的水，沸騰后煎30 min，合并兩次濾液濃縮并減壓干燥，研制成粉末。

1.3試劑 DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基（Invitrogen，美國(guó)），標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清（Gibco，美國(guó)），0.25%胰酶消化液（Hyclone，美國(guó)），雙抗（Penicillin-Streptomycin Solution，Hyclone，美國(guó)）。H2O2（北京化工廠），二甲基亞砜（DMSO，Sigma，美國(guó)）。MDA，SOD，GSH-Px和CAT檢測(cè)試劑（南京建成生物工程研究所）。

1.4儀器 熒光正置顯微鏡DM4000B（Leica，德國(guó)），二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱Heraeus BB15（Thermo Scientific，美國(guó)），超凈工作臺(tái)ZHJH-C1115B（上海智成分析儀器制造有限公司），立式壓力蒸汽滅菌器（江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司），微孔板掃描酶標(biāo)儀（BioTek insrument，美國(guó)），低溫離心機(jī)Labofuge 400R（Thermo Electron，德國(guó)）。

2實(shí)驗(yàn)方法

2.1 心肌細(xì)胞的分離與培養(yǎng)

新生大鼠75%酒精消毒皮膚，迅速開(kāi)胸，無(wú)菌條件下取心室肌，放入PBS液中清洗2～3次，放入無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)液中，剪成1～1.5 mm3的碎塊，移入離心管中，1000 r·min-1離心3 min，棄上清，加入0.08%的胰酶置于37℃水浴中，消化6～7次，每次消化10 min。前兩次棄上清，從第3次起收集心肌細(xì)胞，過(guò)200目篩，1000 r·min-1離心5 min后加入含15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，以差速分離法去除已貼壁的成纖維細(xì)胞，取上清液計(jì)數(shù)并稀釋細(xì)胞密度為1×105個(gè)·L-1。接種于96孔板，每孔100 μl，于37℃、CO2培養(yǎng)箱中靜置貼壁培養(yǎng)。每24 h更換1次培養(yǎng)液，48 h后選生長(zhǎng)狀態(tài)良好的心肌細(xì)胞分組處理，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.2 細(xì)胞存活率測(cè)定

96孔板接種細(xì)胞，單層融合后，每孔加入100μl MTT （1g·L-1 ），置于37℃、5%CO2孵箱中孵育4 h，取出后吸棄培養(yǎng)液，每孔加入100μl DMSO，微樣振蕩器震蕩10 min，于酶標(biāo)儀570 nm處讀取吸光度值，計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率/% = 各組吸光度值（A） /空白組吸光度值（A） × 100%

2.3 天七方對(duì)正常乳鼠心肌細(xì)胞的影響

取接種于96孔板培養(yǎng)48 h后的心肌細(xì)胞，棄除原培養(yǎng)液，用PBS液洗兩次。正常組每孔加入不含F(xiàn)BS的DEMA培養(yǎng)液100 μl，給藥組每孔加入含天七方終濃度分別為5、10、20 mg·L-1的不含F(xiàn)BS的DEMA培養(yǎng)液100 μl，在孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率。

2.4 H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷模型的建立

取接種于96孔板培養(yǎng)48 h后的心肌細(xì)胞，吸棄原培養(yǎng)液，用PBS液洗兩次。正常組每孔加入不含F(xiàn)BS的DMEM培養(yǎng)液100 μl；模型組每孔加入H2O2終濃度分別為50、100、200、400和800μmol·L-1不含F(xiàn)BS的DMEM培養(yǎng)液100 μl，在孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)5 h后，采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞抑制率。確定建立H2O2損傷模型的最適條件。

2.5 天七方對(duì)H2O2損傷心肌細(xì)胞保護(hù)作用的量效關(guān)系研究

取接種于96孔板培養(yǎng)48 h后的心肌細(xì)胞，將細(xì)胞分成正常組、模型組和天七方組（5、10和20 mg·L-1）。正常對(duì)照組每孔加100 μl無(wú)血清培養(yǎng)基；模型組，每孔加入不含F(xiàn)BS、含H2O2的DEMA培養(yǎng)液100 μl，終濃度為200 μmol·L-1，放入CO2孵箱，37℃培養(yǎng)；天七方組5、10和20 mg·L-1各劑量組分別預(yù)孵4 h后，棄上清，加100μl的200 μmol·L-1H2O2作用5 h后，MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率/% = 各組吸光度值（A）/空白組吸光度值（A）×100%。

2.6 天七方對(duì)H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷中CAT、SOD、和GSH-Px活力和MDA含量的影響

各組處理同“1.3.5”，在6孔板中，消化收集各組細(xì)胞，每組加1 ml PBS使細(xì)胞重懸，采取反復(fù)凍融的方法（-80℃冰箱15 min，室溫20 min，如此重復(fù)5次）裂解細(xì)胞，進(jìn)行BCA定量，然后按照試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)細(xì)胞裂解液進(jìn)行SOD、CAT、GSH-Px活力及MDA含量的測(cè)定。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以X±s表示，各組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩樣本比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)。

3 結(jié)果

3.1 天七方單獨(dú)給藥對(duì)心肌細(xì)胞的影響

結(jié)果顯示，天七方各劑量組（5、10和20 mg·L-1）預(yù)孵育24 h，與空白組相比，對(duì)正常心肌細(xì)胞無(wú)明顯損傷（p>0.05）。結(jié)果如Fig. 1所示。

4討論

在過(guò)去的幾十年里，缺血性心臟病的發(fā)病率和死亡率呈逐漸上升的趨勢(shì)。而由于缺血性心臟病的高危因素如糖尿病、肥胖和吸煙等的普遍流行以及老齡人口的增多更可預(yù)示未來(lái)缺血性心臟病對(duì)人類(lèi)健康的威脅[3]。雖然目前對(duì)于缺血性心臟病的治療如藥物治療及冠脈介入治療等取得了較好的療效，但仍存在一定的問(wèn)題[4]。藥物治療易產(chǎn)生不良反應(yīng)，介入治療可導(dǎo)致繼發(fā)性損傷，而傳統(tǒng)中藥因其臨床有效性和其可靠的安全性而逐漸得到世界范圍內(nèi)醫(yī)學(xué)工作者的認(rèn)可。

氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡在缺血性心臟病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮了重要作用[5]。心肌細(xì)胞內(nèi)活性氧自由基在細(xì)胞內(nèi)的異常增多可導(dǎo)致生物大分子的損傷性修飾，而最終通過(guò)不同信號(hào)途徑導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡性死亡的發(fā)生[6-7]。由于心肌細(xì)胞是終末分化的細(xì)胞，不具備增殖能力，因此心肌細(xì)胞的凋亡導(dǎo)致心肌細(xì)胞大量丟失，而嚴(yán)重影響病人的預(yù)后。因此，氧化應(yīng)激誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡是缺血性心臟病治療的重要靶點(diǎn)之一。

天七方是臨床應(yīng)用證實(shí)有效的經(jīng)驗(yàn)方，由紅景天，三七，柴胡和太子參四味中藥組成。在此方中，紅景天可活血、通脈止痛，三七止血散瘀、消腫止痛，而柴胡和太子參有疏散益氣的功效。在本研究中，H2O2處理顯著增加細(xì)胞凋亡性死亡發(fā)生的比例，而天七方對(duì)H2O2引起的乳鼠心肌細(xì)胞凋亡具有明顯的保護(hù)作用。

細(xì)胞凋亡又稱(chēng)程序性細(xì)胞死亡（Programmed cell death），是在完整的細(xì)胞膜內(nèi)經(jīng)一系列蛋白酶和核酸酶調(diào)節(jié)的主動(dòng)的死亡方式。氧化應(yīng)激通常是指ROS產(chǎn)生和清除的不平衡導(dǎo)致的ROS在細(xì)胞內(nèi)的過(guò)量聚集，其可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[8]。細(xì)胞具有一套內(nèi)源性的抗氧化酶類(lèi)物質(zhì)用于對(duì)抗ROS的可能的損傷作用，其中包括超氧化物歧化酶（SOD），過(guò)氧化氫酶（CAT）和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）。研究顯示提高抗氧化酶的活性可對(duì)不同形式的氧化性損傷具有保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明與空白組相比H2O2明顯抑制SOD、CAT和GSH-Px酶活性，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS不能被及時(shí)清除。天七方預(yù)處理可明顯增加SOD、CAT和GSH-Px酶活性，提示天七方保護(hù)心肌細(xì)胞的作用機(jī)制是抗氧化作用，這與以往報(bào)道的紅景天在缺氧/復(fù)氧模型中保護(hù)心肌組織中SOD活性，降低MDA含量的結(jié)果相一致[9]。此結(jié)果說(shuō)明天七方可能通過(guò)增強(qiáng)機(jī)體清除氧自由基的能力，減少氧自由基、羥自由基的生成、抑制脂質(zhì)過(guò)氧化從而抑制心肌損傷，這可能是天七方抗氧化應(yīng)激的重要機(jī)制之一。

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