實(shí)時(shí)熒光PCR用于流感病毒檢測的效果分析

陳燁

【摘 要】 目的 探討和研究實(shí)時(shí)熒光逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)在流感病毒檢測中的應(yīng)用效果。方法 采用實(shí)時(shí)熒光PCR對617例流感樣病例患者的咽拭子標(biāo)本進(jìn)行流感病毒核酸的測定，對檢測出的陽性標(biāo)本采用MDCK進(jìn)行培養(yǎng)并分離，對兩種方法的檢測結(jié)果進(jìn)行分析，對比特異性及靈敏度。結(jié)果 本組617例標(biāo)本中實(shí)時(shí)熒光PCR共檢測出陽性標(biāo)本152例，陽性率24.6%；細(xì)胞培養(yǎng)法在此152例陽性標(biāo)本中共分離出流感病毒79例，陽性率12.8%，實(shí)時(shí)熒光PCR檢測陽性率顯著高于細(xì)胞培養(yǎng)法，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 實(shí)時(shí)熒光PCR能夠快速有效的檢測出流感病毒核酸，是實(shí)驗(yàn)室快速診斷的有效手段。

【關(guān)鍵詞】 實(shí)時(shí)熒光PCR；細(xì)胞培養(yǎng)法；；流感病毒

【中圖分類號】 R446.11+3 【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】 B

流行性感冒是臨床上最為常見的急性呼吸道傳染病，主要是由A、B、C三種流感病毒所引起，其中A、B型病毒存在變異大、危害強(qiáng)的特點(diǎn)，對患者的健康造成了很大的威脅[1]。筆者近年來采用實(shí)時(shí)熒光PCR對A、B型流感病毒進(jìn)行了檢測，并與細(xì)胞培養(yǎng)法進(jìn)行了對比，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本、試劑及器材 標(biāo)本選取為湖南桃源縣監(jiān)測哨點(diǎn)醫(yī)院在流感爆發(fā)時(shí)就診的流感樣病例（體溫38℃以上，伴有咳嗽、咽痛等癥狀），共617例患者，取咽拭子標(biāo)本置于采樣液中，于24h內(nèi)送至實(shí)驗(yàn)室。選取7500實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）檢測系統(tǒng)，RNA提取試劑盒由QIAGEN公司提供，反應(yīng)試劑盒由北京北瑞達(dá)醫(yī)藥科技有限公司提供，狗腎傳代細(xì)胞（MDCK）由湖南省疾病預(yù)防控制中心提供，抗A、抗B系病毒血清均由國家流感中心提供。

1.2 實(shí)時(shí)熒光PCR檢測 對所采集的617例標(biāo)本進(jìn)行病毒核酸檢測，RNA提取及反應(yīng)體系均按照試劑盒說明進(jìn)行，采用SDS軟件進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR系統(tǒng)的操作并設(shè)置陽性、陰性對照，反應(yīng)程序包括：50℃（30min）、95℃（3min）、95℃（15s）、50℃（30min）、72℃（1min），設(shè)定5個(gè)循環(huán)；95℃（10s）、55℃（40s），設(shè)定40個(gè)循環(huán)。熒光素設(shè)定為FAM，55℃時(shí)進(jìn)行熒光信號的收集。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)法檢測 對實(shí)時(shí)熒光PCR檢測到的陽性標(biāo)本采用細(xì)胞培養(yǎng)法進(jìn)行分離、接種及分型。每份標(biāo)本按25ml/瓶接種，2瓶/份，次日觀察是否出現(xiàn)細(xì)胞病變（CPE）。利用人O型紅細(xì)胞進(jìn)行血凝試驗(yàn)，觀察血凝素（HA）及其滴度，將HA滴度<1：8或存在陰性培養(yǎng)物盲傳2代后仍存在陰性者棄去。HA滴度符合試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)者采用國家流感中心提供的標(biāo)準(zhǔn)參照血清進(jìn)行HAI試驗(yàn)，對病毒進(jìn)行分型。

1.4 敏感性及特異性檢測 對細(xì)胞培養(yǎng)法檢測出的陽性菌株取細(xì)胞培養(yǎng)液，按照實(shí)時(shí)熒光PCR檢測步驟再次進(jìn)行檢驗(yàn)和分型。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 16.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料用x±s表示，計(jì)數(shù)資料對比用X2檢驗(yàn)，P<0.05視為對比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)時(shí)熒光PCR檢測結(jié)果顯示，617份疑似病例中共檢測出152例陽性病例，陽性率24.6%，對A、B型流感病毒的分型檢測分別得到133例和19例，分別占87.5%和12.5%。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)法檢測結(jié)果顯示，在實(shí)時(shí)熒光PCR檢測得到的152例陽性菌株中，獲得79份流感病毒，總體陽性率12.8%，A、B流感病毒分型結(jié)果分別為66例和13例，分別占83.5%和16.5%。

2.3 檢測結(jié)果對比顯示，實(shí)時(shí)熒光PCR檢測陽性率要顯著高于細(xì)胞培養(yǎng)法，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；在分型檢測對比上，兩組并無顯著性差異（P>0.05）。

3 討論

目前流感病毒的實(shí)驗(yàn)室診斷經(jīng)典方法即為病毒的分離與鑒定，采用細(xì)胞培養(yǎng)法分離的流感病毒能夠保證其抗原性與原始標(biāo)本的一致，便于長期保存，在對該病毒抗原性和基因分析上有著較好的應(yīng)用，但MDCK細(xì)胞分離的病毒不能用于疫苗的生產(chǎn)，從目前臨床研究結(jié)果來看[2]，細(xì)胞培養(yǎng)法的檢出率和病毒載量、被檢樣品質(zhì)量等存在一定相關(guān)，一旦被檢樣品質(zhì)量較少或病毒載量不足時(shí)就容易導(dǎo)致假陰性的產(chǎn)生。另外，細(xì)胞培養(yǎng)法僅針對活體病毒有效，在標(biāo)本的采集、保存過程中要注意保持病毒活性。

實(shí)時(shí)熒光PCR能夠快速、準(zhǔn)確的對流感病毒進(jìn)行檢測，在2009年發(fā)生的甲型H1N1疫情中有著重要的作用。雖然細(xì)胞培養(yǎng)法是目前流感試驗(yàn)中最可靠的方案之一[3]，但此種方法對標(biāo)本質(zhì)量要求過高，操作復(fù)雜且試驗(yàn)周期較長，在流感疫情爆發(fā)，需要快速進(jìn)行診斷時(shí)存在較大弊端[4，5]。從本文數(shù)據(jù)來看，實(shí)時(shí)熒光PCR檢測陽性率顯著高于細(xì)胞培養(yǎng)法，且對細(xì)胞培養(yǎng)法獲得的79株流感病毒進(jìn)行PCR分型結(jié)果與HAI實(shí)驗(yàn)結(jié)果相吻合，這說明實(shí)時(shí)熒光PCR的特異性值得肯定，同時(shí)具有方便快捷、高通量的特點(diǎn)，能夠適用于流感病毒爆發(fā)期的快速、大面積檢查，能夠在3h內(nèi)提供詳細(xì)檢測結(jié)果，為臨床提供必要依據(jù)。

綜上所述，實(shí)時(shí)熒光PCR能夠快速有效的檢測出流感病毒核酸，具有簡單快捷、高通量、高特異性的特點(diǎn)，是流感疫情爆發(fā)時(shí)實(shí)驗(yàn)室快速診斷的有效手段。

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