NSF對(duì)慢性腎衰模型大鼠微炎癥狀態(tài)相關(guān)細(xì)胞因子影響的實(shí)驗(yàn)研究

趙靜等

【摘 要】目的： 研究NSF對(duì)5/6腎切除模型大鼠微炎癥狀態(tài)相關(guān)細(xì)胞因子的影響。方法 ：將SD大鼠72隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組、NSF組，實(shí)施5/6腎切除術(shù)建立大鼠慢性腎功衰模型；治療組自二次術(shù)后第31天起給藥，連續(xù)30天。檢測(cè)大鼠血Urea、Crea，殘余腎組織病理情況確定模型建立，檢測(cè)微炎癥狀態(tài)相關(guān)細(xì)胞因子：血清腫瘤壞死因子α（TNF-α）和白細(xì)胞介素6（IL-6）的變化。結(jié)果： NSF組與模型組比較：Urea、Crea明顯降低 （ P<0.05），腎臟病理改變較輕，血清TNF-α和IL-6的表達(dá)明顯降低（P<0.05）。結(jié)論： NSF能通過(guò)下調(diào)5/6腎切除模型大鼠TNF-α和IL-6的表達(dá)，改善其微炎癥狀態(tài)，延緩慢性腎衰竭的發(fā)展。

【關(guān)鍵詞】5/6腎切除模型；微炎癥狀態(tài)；血清腫瘤壞死因子α；白細(xì)胞介素6

【中圖分類(lèi)號(hào)】R285.5 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】B 【文章編號(hào)】1004-7484（2014）04-2165-02

Experimental study on effect of NSF on micro inflammation state related cytokines of CRF model rats

ZHAO Jing1 LIU Weiwei1 LI Xueping1 ZHANG Baocheng1 MI Jun2 GAO Yongxiang1*

（1. Chengdu University of TCM， Chengdu， Sichuan 610075； 2. Nanshan Pharmaceutical Ltd. ， Chengdu， Sichuan 610041）

【Abstract】Objective：To research the effects of NSF on micro inflammation state related cytokines of CRF model rats induced by 5/6 nephrectomy. Methods： 72 SD rats were divided into sham-operated group， vehicle control group， positive control group and NSF groups. Chronic Renal Failure was induced by 5/6 nephrectomy. On the 31st day after the 2nd surgery， the positive control group and NSF groups were administrated for 30 days. The model was evaluated by the content of Urea， Crea in blood serum and renal excisional biopsy. The micro inflammation state related cytokines， such as TNF-α and IL-6 were observed. Results： Compared with vehicle control group， the content of Urea and Crea in NSF groups was significantly lower （P<0.05）， the renal pathological changes was milder， and the secretion of TNF-α and IL-6 was significantly decreased （P<0.05）. Conclusions： NSF could improve the micro inflammation state of CRF model rats， and slow the progression of CRF by down-regulating TNF-α and IL-6.

【Key words】5/6 nephrectomy model， micro inflammation state， TNF-α， IL-6

慢性腎衰竭（CFR）是各型原發(fā)或繼發(fā)性腎臟疾病后期，以代謝產(chǎn)物和毒物潴留，水、電解質(zhì)、酸堿平衡紊亂及某些內(nèi)分泌功能異常為主要表現(xiàn)的臨床綜合征，是各種慢性腎臟疾病終末期的共同表現(xiàn)。其末期治療常依靠維持性血液透析（mainteinance hemodialysis，MHD）或腎臟移植維持生命，給社會(huì)、家庭及患者帶來(lái)沉重負(fù)擔(dān)。但即使接受上述治療，透析相關(guān)疾病和腎移植后免疫狀態(tài)紊亂導(dǎo)致的相關(guān)疾病仍嚴(yán)重影響患者的長(zhǎng)期生存。近年諸多研究發(fā)現(xiàn)[1] [2]，微炎癥狀態(tài)在MHD患者中普遍存并參與透析相關(guān)疾病發(fā)生，且微炎癥狀態(tài)在CFR 進(jìn)展惡化中，也發(fā)揮重要作用，影響患者預(yù)后。中藥地耳草具有保肝、抗菌、增強(qiáng)免疫作用，臨床常應(yīng)用于肝炎的治療[3]，在腎功能衰竭患者的腎功改善方面也有臨床報(bào)道[4] [5]。NSF是地耳草提取的有效成分提取物，本課題組前期研究顯示NSF能延緩慢性腎衰的發(fā)展。為進(jìn)一步研究NSF對(duì)CFR治療作用及對(duì)微炎癥狀態(tài)的影響，探索其對(duì)慢性腎衰的防治機(jī)制，本研究通過(guò)建立5/6腎切除大鼠模型，選取微炎癥狀態(tài)相關(guān)細(xì)胞因子TNF-α和IL-6進(jìn)行檢測(cè)，觀察藥物對(duì)腎功能及微炎癥狀態(tài)的改善作用。

1 材料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性清潔級(jí)SD大鼠72只，體重（210±10）g，成都中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供。常規(guī)條件下飼養(yǎng)，自由飲水，普通飲食，適應(yīng)性喂養(yǎng)7天。

1.2實(shí)驗(yàn)用藥

NSF由成都南山藥業(yè)有限公司提供，依照委托單位提供的供試品人臨床擬用劑量（1.2g/人.日）為主要依據(jù)，按照體表面積換算成大鼠的等效劑量（人的體重按60kg計(jì)）。

金水寶膠囊，江西濟(jì)成可信金水寶制品有限公司，批號(hào)，20111203，以臨床人用量（0.33g/粒，18粒/人日）經(jīng)體表面積轉(zhuǎn)換成大鼠等效劑量作為本實(shí)驗(yàn)劑量。

1.3主要試劑與儀器

全自動(dòng)生化分析儀：日立7180型；

顯微鏡：德國(guó)萊卡顯微鏡，德國(guó)萊卡病理圖像分析系統(tǒng) DM2000；

類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清：中美合資蘭州民海生物工程有限公司 批號(hào)：20100424；

雙抗100X：PAA-Strasse1.4061 Pasching .Austria 貨號(hào)：P11-010 批號(hào)：P01010-1446；

免疫組化試劑盒：生產(chǎn)商：北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號(hào)： FP-0023；

2 方法

2.1模型制作 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7天，稱(chēng)重，編號(hào)，隨機(jī)分為4組，每組選取18只為假手術(shù)組，剩余54只采用5/6腎切除術(shù)制作大鼠腎衰模型。腹腔注射10%水合氯醛輔以乙醚麻醉大鼠，俯臥固定于手術(shù)臺(tái)上，局部剪毛，左側(cè)肋下脊直肌外側(cè)皮膚常規(guī)消毒，無(wú)菌操作下，切開(kāi)各層，暴露左腎，分離固定。切開(kāi)左腎上下兩極包膜，切除上下兩極約單側(cè)腎臟2/3，用明膠海綿壓迫止血后縫合各層。腹腔注射青霉素預(yù)防感染。術(shù)后7天第二次手術(shù)，同樣方法麻醉，切開(kāi)右側(cè)背部暴露右腎，結(jié)扎腎蒂，全切右腎。

2.2分組給藥 手術(shù)操作后的大鼠隨機(jī)分為3組，每組18只。分別為模型對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組、NSF組。所有大鼠于二次手術(shù)后第31天開(kāi)始灌胃給予相應(yīng)藥物：假手術(shù)組和模型對(duì)照組以0.5%CMC-Na溶液灌胃，1ml/100g.bw；陽(yáng)性對(duì)照組：金水寶膠囊5.7mg/kg；NSF組：NSF120 mg/kg。連續(xù)給藥30天。

2.3 標(biāo)本收集 用完藥后禁食12h，次日稱(chēng)重，10%水合氯醛麻醉，腹主動(dòng)脈取血。留取血清做生化檢測(cè)及elisa檢測(cè)。處死后，取大鼠殘余腎臟組織，置于4%多聚甲醛中固定，備病理學(xué)觀察。

2.4檢測(cè)指標(biāo)及方法

2.4.1一般情況觀察 動(dòng)態(tài)觀察造模期間大鼠存活率、進(jìn)食情況、精神狀態(tài)、活動(dòng)度、皮毛光澤度等。

2.4.2血清Urea、Crea 用藥完成后，10%水合氯醛麻醉，腹主動(dòng)脈取血。留取血清，以全自動(dòng)血生化分析儀檢測(cè)Urea、Crea變化。

2.4.3腎臟組織病理 最后一次給藥后次日，麻醉處死大鼠，取殘余腎臟組織于4%多聚甲醛中固定，修塊后經(jīng)自動(dòng)脫水機(jī)退水處理、包埋、切片，行HE染色，顯微鏡下觀察腎臟病理改變。

2.4.4血清微炎癥狀態(tài)細(xì)胞因子TNF-α、IL-6檢測(cè)最后一次給藥后次日，10%水合氯醛麻醉，腹主動(dòng)脈取血。留取血清，采用ELISA法檢測(cè)TNF-α、IL-6含量。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 計(jì)量資料以（ ±s）表示，用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行非參數(shù)檢驗(yàn)和單因素方差分析。

3 結(jié)果

3.1一般情況 實(shí)驗(yàn)期間，正常大鼠全部存活，飲食飲水正常，活動(dòng)靈活，皮毛光澤。造模處理后各組大鼠均出現(xiàn)死亡，各組存活率分別為：模型組66.67%，陽(yáng)性對(duì)照組55.56%，NSF組77.78%；造模后各組大鼠均出現(xiàn)不同程度進(jìn)食飲水量下降，精神萎靡惡動(dòng)，毛色發(fā)黃干枯，體態(tài)消瘦等。尤其以模型組最為嚴(yán)重，治療后，陽(yáng)性對(duì)照組和NSF組均較模型組有一定程度恢復(fù)，進(jìn)食、活動(dòng)均有增加。

3.2血清Urea、Crea 各組大鼠Urea、Crea增高，與假手術(shù)組相比，具有顯著差異（p<0.05），表明造模成功；NSF組、陽(yáng)性對(duì)照組與模型組比較Urea、Crea降低，有顯著差異（p>0.05），表明NSF能降低血Urea、Crea的含量。（表1）

3.3腎臟病理變化 肉眼觀察，造模后殘余腎臟包膜增厚、變硬，表面粗糙部分區(qū)域有隆起，切面暗紅，和周?chē)M織有粘連；鏡下，正常組腎臟腎小體、腎小管及間質(zhì)未見(jiàn)明顯異常。模型組腎球囊部分臟層上皮細(xì)胞增生，囊壁增厚，少數(shù)腎小球球囊發(fā)生粘連；大部分腎小球系膜細(xì)胞增生，基質(zhì)增生，嗜酸性增強(qiáng)，少量血管球毛細(xì)血管腔節(jié)段性閉塞，可見(jiàn)毛細(xì)血管球內(nèi)微血栓形成，血管球局部呈均質(zhì)紅染。絕大多數(shù)小管上皮細(xì)胞水腫，部分腎小管萎縮消失，部分小管擴(kuò)張，少數(shù)極度擴(kuò)張呈囊性。小管中可見(jiàn)較多蛋白和細(xì)胞管型。腎臟間質(zhì)慢性炎細(xì)胞浸潤(rùn)，伴纖維組織增生。腎臟包膜增厚，可見(jiàn)均質(zhì)紅染改變。出現(xiàn)慢性腎衰纖維化的病理改變，病變程度較重，腎衰模型建立成功。

模型對(duì)照組比較，陽(yáng)性對(duì)照組和NSF組腎小球囊臟層上皮細(xì)胞增生例數(shù)較少；腎小體血管球系膜增生程度較輕；變性血管球數(shù)量稍少，未見(jiàn)血管球毛細(xì)血管腔節(jié)段性閉塞；間質(zhì)炎細(xì)胞浸潤(rùn)例數(shù)及纖維組織增生例數(shù)較少。腎小管萎縮、擴(kuò)張病變無(wú)改善?？梢?jiàn)陽(yáng)性對(duì)照組和NSF組大鼠5/6腎切除殘余腎臟腎小體及間質(zhì)病變發(fā)生率減低。提示NSF對(duì)腎臟纖維化有抑制作用，有減輕病變程度的作用。

3.4血清TNF-α、IL-6檢測(cè) ELISA方法檢測(cè)外周血中TNF-α、IL-6的含量，結(jié)果顯示NSF組、陽(yáng)性對(duì)照組、假手術(shù)組TNF-α和IL-6含量均明顯低于模型對(duì)照組（P<0.05）；三組組間比較無(wú)統(tǒng)顯著差異（P>0.05）。（表2）

4 討論

早在2000年，Schoming等科學(xué)家就提出尿毒癥患者體內(nèi)存在微炎癥狀態(tài)（microinf lammatory state）。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)[6]，原發(fā)及各種繼發(fā)腎臟疾病均存在機(jī)體免疫功能失常，由于腎臟功能逐漸失代償，體內(nèi)代謝產(chǎn)物蓄積可刺激機(jī)體各種炎性因子異常表達(dá)，最終機(jī)體將處于長(zhǎng)期炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激狀態(tài)。CFR與微炎癥兩者客觀共存，CFR本身可以導(dǎo)致炎癥應(yīng)答，誘發(fā)炎癥狀態(tài)；而微炎癥又是CRF的加重因素，通過(guò)多因素多途徑參與并加重CRF病程的進(jìn)展及其并發(fā)癥的發(fā)生，加速腎功能的惡化，兩者相互促進(jìn)，形成惡性循環(huán)[7]。微炎癥狀態(tài)下，機(jī)體發(fā)生以單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)激活TNF-α、IL-6為主的促炎癥細(xì)胞釋放為中心的炎癥反應(yīng)。國(guó)內(nèi)外研究報(bào)道[8] [9]，CRF無(wú)論透析或非透析狀態(tài)，都存在明顯微炎癥狀態(tài)，TNF-α、IL-6等關(guān)鍵細(xì)胞因子較正常明顯增高；早期發(fā)現(xiàn)和干預(yù)微炎癥狀態(tài)，降低TNF-α、IL-6等細(xì)胞因子水平，對(duì)慢性腎臟病患者的預(yù)后有十分重要的臨床意義。

目前對(duì)微炎癥狀態(tài)的干預(yù)治療仍缺乏一種有效的方法。相關(guān)研究報(bào)道表明他汀類(lèi)藥物、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑、受體拮抗劑、左旋卡尼汀、抗氧化劑等藥物的使用，可在不同程度上干預(yù)和改善患者的微炎癥狀態(tài)。但微炎癥狀態(tài)的發(fā)生發(fā)展中，復(fù)雜的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和信息分子之間對(duì)的交叉對(duì)話，導(dǎo)致單一因素或單一作用靶點(diǎn)的藥物應(yīng)用效果并不理想。能通過(guò)多靶點(diǎn)、多途徑發(fā)揮綜合療效的藥物成為研究熱點(diǎn)。

NSF是中藥地耳草有效成分的提取物。地耳草，又名田基黃、趕黃草，具有利濕退黃、清熱解毒、活血消腫、散瘀止痛等功效。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中主要應(yīng)用于肝炎治療，亦有治療肝硬化的報(bào)道。現(xiàn)代藥理學(xué)研究，進(jìn)一步揭示了地耳草的藥理作用包括保肝、抗氧化、治療肝炎、抑菌、抗病毒、調(diào)節(jié)免疫、抑制腫瘤細(xì)胞等。地耳草應(yīng)用于腎病治療，雖有臨床報(bào)道，但未見(jiàn)系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)研究。

本課題組前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，NSF對(duì)慢性腎衰竭模型大鼠有改善腎臟功能的作用，對(duì)模型大鼠腎臟纖維化及纖維化相關(guān)細(xì)胞因子有干預(yù)效果。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)采用5/6腎切除大鼠模型，觀察NSF對(duì)模型大鼠腎功、腎臟病理形態(tài)學(xué)變化，確立藥物對(duì)腎衰模型的治療作用；并選取CRF時(shí)微炎癥狀態(tài)相關(guān)的細(xì)胞因子指標(biāo)TNF-α、IL-6進(jìn)行檢測(cè)，探索藥物對(duì)腎衰微炎癥狀態(tài)的干預(yù)作用。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示腎衰模型成功建立，NSF對(duì)該模型大鼠腎臟功能改變及形態(tài)學(xué)病變均有改善作用；5/6腎切除大鼠模型組血清TNF-α、IL-6表達(dá)均增加，與國(guó)內(nèi)外臨床及實(shí)驗(yàn)報(bào)道結(jié)果一致；而NSF組血清TNF-α、IL-6表達(dá)下降，該結(jié)果提示NSF能下調(diào)模型大鼠TNF-α和IL-6的表達(dá)，改善其微炎癥狀態(tài)，延緩慢性腎衰竭的發(fā)展。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，可考慮加入NSF對(duì)微炎癥狀態(tài)相關(guān)并發(fā)癥效應(yīng)指標(biāo)的檢測(cè)。如NSF對(duì)CRF的血脂及血脂相關(guān)細(xì)胞因子的影響，探索NSF通過(guò)改善CRF微炎癥狀態(tài)，發(fā)揮其對(duì)終末腎病常見(jiàn)并發(fā)癥動(dòng)脈粥樣硬化的防治作用。為后續(xù)進(jìn)一步發(fā)掘中藥地耳草對(duì)慢性腎衰及其并發(fā)癥的防治機(jī)制，開(kāi)拓地耳草在疾病治療中的應(yīng)用領(lǐng)域打下基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

[1] 曹婭麗，王世相. 維持性血液透析患者慢性炎癥狀態(tài)的研究現(xiàn)狀[J]. 中國(guó)血液凈化， 2006， 5（12）： 848-851.

[2] 王娟，王智. 慢性腎衰竭與微炎癥反應(yīng)[J].廣州醫(yī)藥， 2006， 37（3）： 5 -7.

[3] 廖仰平，賴岳曉，葉建新，等. 田基黃及其制劑的研究進(jìn)展[J]. 中醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)， 2012， 18（3）： 109-111.

[4] 余曉紅. 地耳草顆粒治療慢性腎功能不全23例[J]. 華西醫(yī)學(xué)， 2009， 24（10）： 2711-2711.

[5] 王邦鼎. 地耳草湯治療急性腎炎62例[J]. 實(shí)用中醫(yī)藥雜志， 2004， 20（9）： 493-493.

[6] Krasniak A， Drozdz M， Pasowicz M， et al. Influence of microin-flammation and oxidative stress on atherosclerosis progression and calcifications in cardiovascular system of hemodialyzed patients during two years follow-up [J]. Przegl Lek， 2007， 64（3）：140-147.

[7] Capeillere-Blandin C，Gausson V， Nguyen AT，et al.Respective role of uraemic toxins and myeloperoxidase in the uraemic state[J].Nephrol Dial Transplant，2006，21（6） ：1555-1563.

[8]Ortega o， Rodriguez I， Gallar P，et al.Significance of high C-reactive protein levels in pre-dialysis patients[J].Nephrol DIAL Translant，2002，17（6）：1105-1109.

[8] 洪麗萍，周曉玲，陳孟華，等.慢性腎臟病非透析患者微炎癥狀態(tài)分析[J].寧夏醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，32（3）：348-351.

作者簡(jiǎn)介：

趙靜（1982— ），女（回族），四川成都人，現(xiàn)任成都中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院講師， 610075，研究方向：中藥免疫安全性與有效性評(píng)價(jià)。

通訊作者簡(jiǎn)介：

高永翔（1965— ），男（漢族），四川成都人，現(xiàn)任成都中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：中藥免疫安全性與有效性評(píng)價(jià)。