豚草提取物對(duì)楊樹爛皮病菌的抑制作用

孫妍 趙紅盈 宋小雙 遇文婧

摘要 [目的]探討豚草提取物對(duì)楊樹爛皮病病原菌的抑制作用，為生物源農(nóng)藥的開發(fā)與利用提供理論依據(jù)。[方法]采用溫浸-超聲波連用提取法對(duì)豚草活性物質(zhì)進(jìn)行了提取，并研究了提取物對(duì)楊樹爛皮病病原菌的抑制作用。[結(jié)果]不同濃度豚草提取物均對(duì)楊樹爛皮病病原菌具有較強(qiáng)的抑制作用并呈線性增長趨勢。[結(jié)論]豚草對(duì)真菌具有一定的抑制作用，且對(duì)生態(tài)環(huán)境及哺乳動(dòng)物無害。

關(guān)鍵詞 豚草;超聲波;楊樹爛皮病病原菌

中圖分類號(hào) S763.1 ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A ?文章編號(hào) 0517-6611（2014）34-12111-02

Inhibition Effect of Crude Extracts of Ambrosia artemisiifolia L. against Cytospora chrysosperma

SUN Yan， ZHAO Hongying， SONG Xiaoshuang et al

（Heilongjiang Institute of Forest Protection，Harbin，Heilongjiang 150040）

Abstract [Objective] The aim was to understand inhibition effect of crude extracts of A. artemisiifolia L. against C. chrysosperma to provide theoretical basis for development and utilization of biopesticide. [Method] Crude extracts of A. artemisiifolia L. Were obtianed by the method of warm immersion with ultrasonic， and inhibition effect of the crude extracts against C. chrysosperma was studied. [Result] Different concentrations of the crude extracts had strong inhibition to the C. chrysosperma and took on linear growth. [Conclusion] A. artemisiifolia L. has certain inhibition to fungi， and is safe for enriroment and mamals.

Key words Ambrosia artemisiifolia L.; Ultrasonic; Cytospora chrysosperma （Pers） Fr.

豚草[1]（Ambrosia artemisiifolia L.），又稱艾葉破布草、美洲艾，隸屬于菊科豚草屬，為1年生草本植物，高30～150 cm，直徑2.5～5.0 mm。其生命力強(qiáng)，易于傳播，種子可隨作物、水流及交通工具攜帶進(jìn)行傳播。豚草原產(chǎn)于墨西哥北部的索諾蘭沙漠地區(qū)和美國西南部，并在俄羅斯、美國、英國、日本等國家均有廣泛分布。約于20世紀(jì)30年代傳入我國東北地區(qū)，近幾年隨著國內(nèi)外交流的日益增多，豚草的種子也隨之傳播到我國各地，并且迅速蔓延，并在華東、華中、華北、東北等至少15個(gè)?。▍^(qū)）都有發(fā)現(xiàn)，一些地區(qū)雖然已經(jīng)大規(guī)模的拔除，但一些路邊及河道仍有不少殘余，且在不斷蔓延。

豚草多生長于荒山空地、路邊、溝旁、田塊周圍或農(nóng)田中，可遮蓋和壓抑作物，阻礙農(nóng)業(yè)操作，與作物爭地爭水，影響作物產(chǎn)量，吸入其花粉還可使人患上呼吸系統(tǒng)疾病，因此它是一種既影響人類健康又影響農(nóng)牧業(yè)生產(chǎn)的危險(xiǎn)性雜草，其繁殖快，危害大，為世界上公認(rèn)的有害植物之一，并素有“植物殺手”之稱，是國內(nèi)外重點(diǎn)檢疫對(duì)象。

楊樹爛皮病[2][Cytospora chrysosperma（Pers.）Fr.]，又稱潰瘍病、腐爛病、臭皮病，病原為污黑腐皮殼（Valsa sordida Nit），屬子囊菌綱球殼菌目間座殼菌科污濁腐皮殼屬，通常以無性世代出現(xiàn)。楊樹爛皮病是綠地、公園、行道樹和苗圃楊樹的常見病和多發(fā)病，經(jīng)常引起行道樹的大量枯死，新移栽的楊樹發(fā)病尤為嚴(yán)重。該病在我國的楊樹栽培區(qū)均有發(fā)生，但主要分布在東北、西北、華北等地。近幾年，該病的發(fā)生量及發(fā)生程度呈上升趨勢[3]。國外對(duì)豚草屬植物研究結(jié)果表明，該屬植物中含有豐富的倍半萜內(nèi)酯類化合物，可嘗試作為生物源農(nóng)藥進(jìn)行研究[4]。為此，筆者利用溫浸-超聲波連用提取法對(duì)豚草的抑菌活性物質(zhì)進(jìn)行了提取，并研究了該提取物對(duì)楊樹爛皮病病原菌的抑制作用及對(duì)小白鼠的安全性，旨在為豚草的生物源農(nóng)藥的開發(fā)與利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1

供試植物。供試豚草采自黑龍江省牡丹江市。將新鮮的豚草清洗干凈，先在通風(fēng)處陰干，然后放入干燥箱中，50 ℃烘干至恒重，用分析型研磨機(jī)研磨粉碎，保存于棕色瓶中，備用。

1.1.2 供試菌種。供試楊樹爛皮病菌種由發(fā)病楊樹上分離鑒定得到。

1.2 方法

1.2.1 植物提取物母液的制備[5-6]。

取10 g豚草植物粉末，裝入300 ml三角瓶中，加入80%乙醇250 ml，置于50 ℃恒溫水浴鍋中溫浸3 h，取出后放到超聲波提取器中振蕩40 min，然后再置于50 ℃恒溫水浴鍋中溫浸3 h，最后將浸好的藥液用真空泵反復(fù)減壓抽濾，得到澄清的乙醇粗提液。將乙醇粗提液在40 ℃下用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行減壓濃縮至原液呈現(xiàn)出濃油狀為止，用10%聚山梨酯80作為溶媒進(jìn)行溶解定容至50 ml（即質(zhì)量濃度為200 mg/ml），物理滅菌后放入4 ℃冰箱保存，備用。

1.2.2 豚草提取物抑菌活性測定方法。

1.2.2.1 PDA培養(yǎng)基的制備。

將洗凈去皮的馬鈴薯200 g切碎，加1 000 ml水煮沸30 min，然后用紗布過濾去除馬鈴薯，再加水定容至1 000 ml，加入18 g瓊脂和20 g蔗糖，加熱至瓊脂完全溶化，趁熱用紗布過濾并分裝于三角瓶中，在121 ℃下加壓蒸汽滅菌20 min后備用。

1.2.2.2 帶毒平板培養(yǎng)基的制備。

將豚草粗提液母液稀釋成0.25、1.00、4.00、20.00、40.00和80.00 mg/ml系列濃度梯度，分別量取一定量各濃度藥液加入到熱培養(yǎng)基中，混合均勻后倒入培養(yǎng)皿內(nèi)，冷凝后即成為帶活性物質(zhì)的培養(yǎng)基。

1.2.2.3 生長速率法測定抑菌率[7]。

用“1.2.2.2”制備的不同濃度含藥培養(yǎng)基培養(yǎng)病原菌，以病原菌菌絲的生長速率快慢判定不同樣品抑制效果的強(qiáng)弱。

用滅菌后的直徑為5 mm的打孔器在培養(yǎng)好的菌落外緣切下帶菌培養(yǎng)基菌餅。用酒精燈火焰滅菌后的接種針或消毒的鑷子將菌餅放置在帶毒培養(yǎng)基和對(duì)照培養(yǎng)基上，菌絲面向下，每皿接1塊，置于26 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔24 h觀察一次，用十字交叉法測量菌落直徑2次，取平均值，計(jì)算菌絲生長抑制率。

菌落生長直徑（mm）=2次直徑平均值-5.0（菌餅直徑）

抑制率=（對(duì)照凈生長直徑-處理生長直徑）/對(duì)照凈生長直徑

1.2.3 豚草粗提物的安全性試驗(yàn)。

選用體重在17～22 g的健康小白鼠，性別相同或雌雄各半。通過胃腸給藥的方式進(jìn)行安全性試驗(yàn)。

豚草提取物設(shè)5個(gè)劑量組，分別為0.50、0.75、1.00、1.25、1.50 ml，分組灌服不同劑量的受試小白鼠。為能得到理想的結(jié)果，試驗(yàn)從中間劑量開始，以便從最初幾個(gè)劑量組動(dòng)物接受藥物后的反應(yīng)來判斷兩端劑量是否合適，便于調(diào)整劑量和組數(shù)。為了提高試驗(yàn)的精確度和節(jié)省藥物，受試藥物按“低比稀釋法”配制。給藥后逐日觀察并記錄小白鼠中毒反應(yīng)、死亡率和死亡情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 豚草提取物對(duì)楊樹爛皮病病原菌菌絲生長的抑制作用

由圖1可知，不同濃度的豚草提取物均在48 h后對(duì)楊樹爛皮病病原菌產(chǎn)生較強(qiáng)的抑制作用，并呈緩慢增長趨勢。0.25 mg/ml豚草提取物對(duì)楊樹爛皮病菌的平均抑菌率為45.67%，1.00 mg/ml豚草提取物的平均抑菌率為51.22%，4.00 mg/ml豚草提取物的平均抑菌率為53.92%，20.00 mg/ml豚草提取物平均抑菌率為60.57%，40.00 mg/ml豚草提取物的平均抑菌率為66.37%，80.00 mg/ml豚草提取物的平均抑菌率為85.13%?？梢?，當(dāng)豚草提取物濃度達(dá)到1.00 mg/ml以上時(shí)，抑菌率均達(dá)到50%以上，當(dāng)豚草提取物濃度達(dá)到80.00 mg/ml時(shí)，抑菌率達(dá)到85%以上。

圖1 不同濃度豚草提取物對(duì)楊樹爛皮病菌的抑制作用

2.2 豚草提取物對(duì)楊樹爛皮病病原菌抑制中濃度（EC50）的確定

由圖2可知，不同濃度豚草提取物對(duì)楊樹爛皮病菌的抑制作用呈線性增長趨勢，濃度越高，豚草提取物對(duì)楊樹爛皮病菌的抑制作用越大，其線性回歸方程為：y=0.442 8x+49.76，R2=0.970 3，相關(guān)性良好，由此得出豚草提取物對(duì)楊樹爛皮病病原菌菌絲的EC50為542.005 mg/L。

圖2 豚草提取物對(duì)楊樹爛皮病菌的抑制作用線性關(guān)系

2.3 豚草粗提物對(duì)小白鼠的致死中量（LD50）的確定

采用改進(jìn)寇氏法，得出豚草粗提液對(duì)小白鼠的LD50為7 466.299 mg/kg 。由圖3可知，豚草粗提物濃度對(duì)數(shù)與校正死亡率機(jī)率值成線性相關(guān)，其線性方程為：y=5.889 2x-17.809，R2=0.937 6，相關(guān)性良好。

圖3 豚草粗提液毒力測定線性關(guān)系

冀農(nóng)[8]根據(jù)農(nóng)藥LD50的多少可將農(nóng)藥的毒性分為以下5級(jí)：

劇毒農(nóng)藥，LD50為1～50 mg/kg（體重）;

高毒農(nóng)藥，LD50為51～100 mg/kg（體重）;

中毒農(nóng)藥，LD50為101～500 mg/kg（體重）;

低毒農(nóng)藥，LD50為501～5 000 mg/kg（體重）;

微毒農(nóng)藥，LD50為5 000 mg/kg（體重）以上。

根據(jù)該農(nóng)藥毒性等級(jí)劃分標(biāo)準(zhǔn)，豚草粗提物的LD50大于5 000 mg/kg，為微毒，對(duì)生態(tài)環(huán)境及哺乳動(dòng)物無害，可作為植物源農(nóng)藥進(jìn)行開發(fā)。

3 結(jié)論

豚草作為入侵植物，近些年來對(duì)其治理的研究報(bào)道較多，而對(duì)于其開發(fā)和利用的研究極少，該研究試圖挖掘其可利用價(jià)值，使其變廢為寶，以達(dá)到以用為治的目的。

植物有效成分的提取多采用單一方法，提取率較低，該研究嘗試運(yùn)用2種方法相結(jié)合的方式來提取豚草的抑菌粗提物，并研究其對(duì)楊樹爛皮病病原菌菌絲的抑制作用。

將浸漬法與超聲波技術(shù)相接合的技術(shù)應(yīng)用于豚草活性物質(zhì)的提取，不僅可保持有效成分的活性，同時(shí)可節(jié)省時(shí)間，簡化提取純化流程，提高提取效率，且該方法易于推廣。豚草的80%乙醇浸漬-超聲波連用技術(shù)的提取物對(duì)楊樹爛皮病原菌的抑制試驗(yàn)結(jié)果表明，豚草提取物對(duì)楊樹爛皮病病原菌有較強(qiáng)的抑制作用，當(dāng)質(zhì)量濃度在80.00 mg/ml時(shí)，抑菌率達(dá)到85%以上，且提取物的濃度與抑制作用呈正相關(guān)，其抑制率呈線性增長趨勢，依據(jù)農(nóng)藥毒性等級(jí)，該提取物為微毒。由

此得出，豚草對(duì)真菌具有一定的抑制作用，且對(duì)生態(tài)環(huán)境及