雙側(cè)乳腺癌CA15—3和CK5/6蛋白表達(dá)及克隆關(guān)系

劉勤 楊偉明　楊雪峰 任宇 蘇曉玥 陳夢(mèng)婷 霍金龍

【摘 要】目的：探討CA15-3和CK5/6在雙側(cè)乳腺癌和單側(cè)乳腺癌的表達(dá)特點(diǎn)，分析雙側(cè)乳腺癌首發(fā)癌和第二癌的克隆關(guān)系。方法：收集雙側(cè)乳腺癌蠟塊標(biāo)本9例，同時(shí)隨機(jī)選取2012年10例單側(cè)乳腺癌作為對(duì)照。運(yùn)用免疫組化法（Envision法）檢測(cè)CA15-3和CK5/6在雙側(cè)乳腺癌首發(fā)癌、第二癌和單側(cè)乳腺癌的表達(dá)。結(jié)果：雙側(cè)乳腺癌首發(fā)癌、第二癌和單側(cè)乳腺癌CA15-3的表達(dá)率分別8/9（88.9%）、7/9（77.8%）、8/10（80%）。雙側(cè)乳腺癌首發(fā)癌、第二癌和單側(cè)乳腺癌CK5/6的表達(dá)率分別6/9（66.7%）、7/9（77.8%）、8/10（80%）。雙側(cè)乳腺癌CA15-3首發(fā)癌和第二癌同時(shí)陽(yáng)性有8例。同時(shí)陰性0例。雙側(cè)乳腺癌CK5/6首發(fā)癌和第二癌同時(shí)陽(yáng)性有6例。同時(shí)陰性1例。結(jié)論：70-90﹪雙側(cè)乳腺癌首發(fā)癌和第二癌是單克隆關(guān)系。

【關(guān)鍵詞】雙側(cè)乳腺癌；CA15-3；CK5/6

【中圖分類(lèi)號(hào)】R737.9 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】1004-7484（2014）04-2119-02

原發(fā)性雙側(cè)乳腺癌左右兩側(cè)癌受到類(lèi)似的激素環(huán)境和遺傳因素的影響，可能顯示出類(lèi)似的生物學(xué)特性[1]。原發(fā)性雙側(cè)乳腺癌先發(fā)生側(cè)為首發(fā)癌，后發(fā)生側(cè)為第二癌。若同時(shí)發(fā)現(xiàn)，則腫塊大者為首發(fā)癌，另一側(cè)為第二癌。第二癌是新發(fā)癌即多克隆還是首發(fā)癌的轉(zhuǎn)移即單克隆，一直是許多學(xué)者研究的熱點(diǎn)[2，3]。本研究擬通過(guò)觀察臨床病理類(lèi)型和CA15-3、CK5/6在雙側(cè)乳腺癌和單側(cè)乳腺癌的表達(dá)特點(diǎn)及雙側(cè)乳腺癌首發(fā)癌和第二癌表達(dá)的差異，來(lái)揭示首發(fā)癌和第二癌的克隆關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 病例選擇 收集遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院2007年1月1日-2013年1月10日共收治雙側(cè)乳腺癌9例臨床病例資料，同時(shí)隨機(jī)選取2012年10例單側(cè)乳腺癌作為對(duì)照，均為女性，所有蠟塊組織均經(jīng)病理科證實(shí)為乳腺癌（見(jiàn)圖A）。

1.2 臨床資料 本組病例雙側(cè)乳腺癌發(fā)病年齡37歲～54歲，平均年齡45歲，絕經(jīng)前7例，絕經(jīng)后2例。9例雙側(cè)乳腺癌均有生育史，其中3例有家族史：1例母親患乳腺癌，1例姐姐患乳腺癌，1例父親患肝癌。10例單側(cè)乳腺癌發(fā)病年齡34-54歲，平均年齡47歲，絕經(jīng)前3例，絕經(jīng)后7例，10例單側(cè)乳腺癌患者無(wú)家族史。

1.3 病理類(lèi)型和TNM分期 雙側(cè)乳腺癌首發(fā)癌中浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌7例，浸潤(rùn)性小葉癌1例，導(dǎo)管內(nèi)癌1例。第二癌浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌 4例，浸潤(rùn)性小葉癌2例，原位癌3例。9例雙側(cè)乳腺癌首發(fā)癌和第二癌TNM分期為0期或Ⅰ期：首發(fā)癌9例為Ⅰ期，第二癌6例Ⅰ期，3例0期。9例雙側(cè)乳腺癌中，首發(fā)癌和第二癌在病理類(lèi)型有6例表現(xiàn)出一致性，TNM分期上表現(xiàn)出一致性[4]，并且兩側(cè)癌中都已浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌為主（見(jiàn)表1）。

1.4 檢測(cè)方法和試劑 所有病例標(biāo)本均經(jīng)10% 福爾馬林溶液固定， 常規(guī)石蠟包埋， 連續(xù)4μm 厚切片， 行Envision法免疫組化染色：二甲苯梯度脫蠟兩次，每次10min，乙醇梯度水化，3%雙氧水浸泡10min去除內(nèi)源性過(guò)氧化酶，CA15-3檸檬酸修復(fù)，CK5/6EDTA微波修復(fù)抗原，自然冷卻后PBS液沖洗3次，每次兩分鐘，滴加牛血清封閉液封閉45分鐘，加一抗室溫放置一小時(shí)，再次PBS液沖洗三次，每次兩分鐘，滴加二抗，室溫放置15min，最后PBS液沖洗3次，每次兩分鐘。DAB顯色，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核，乙醇梯度脫水，透明，中性樹(shù)膠封片。鼠抗人乳腺癌相關(guān)抗原（CA15-3） 單克隆抗體（工作液濃度 1︰100）和鼠抗人CK5/6單克隆抗體（工作液濃度 1︰100）均購(gòu)自北京中杉金橋公司。二抗試劑盒購(gòu)于美國(guó)基因公司。CA15-3用已知陽(yáng)性的乳腺癌組織切片做陽(yáng)性對(duì)照（見(jiàn)圖B），CK5/6用正常皮膚組織切片做陽(yáng)性對(duì)照（見(jiàn)圖C），以PBS 代替一抗做陰性對(duì)照（見(jiàn)圖D）。

1.5 結(jié)果判斷 CA15-3陽(yáng)性染色部位為細(xì)胞膜或細(xì)胞漿（見(jiàn)圖E-G），CK5/6陽(yáng)性染色部位為細(xì)胞漿（見(jiàn)圖H-J）。以染色部位出現(xiàn)棕黃色或棕褐色為陽(yáng)性表達(dá)，每張切片選取10個(gè)不同部位，400倍視野進(jìn)行拍攝。參照許良中等的方法[5]每張切片陽(yáng)性細(xì)胞的著色強(qiáng)度按無(wú)著色、淡黃色、棕黃色和棕褐色分別評(píng)分0、1、2、3 分。根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞在所觀察細(xì)胞（ 100 個(gè)） 中所占比例評(píng)分：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)< 5% 為0 分，6% ～ 25% 為1 分，25% ～ 50% 為2 分，> 50%為3 分。然后根據(jù)兩項(xiàng)評(píng)分之和判斷其結(jié)果： 0 分為（ - ） ， 2 分為（ +） ， 3～4 分為（ ++） ， 5～6 分為（ +++） 。（ - ） 為表達(dá)陰性； （ +） 為低表達(dá)； （ ++） ～（ +++）為高表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 CA15-3和CK5/6在雙側(cè)乳腺癌的表達(dá) CA15-3和CK5/6在雙側(cè)乳腺癌的表達(dá)：免疫組化結(jié)果顯示：CA15-3表達(dá)于乳腺癌細(xì)胞的細(xì)胞膜或細(xì)胞漿，以細(xì)胞膜或細(xì)胞漿出現(xiàn)棕黃色或棕褐色網(wǎng)格狀陽(yáng)性染色為主。CK5/6表達(dá)于乳腺癌細(xì)胞的細(xì)胞漿，以細(xì)胞漿染成棕黃色或棕褐色網(wǎng)格狀為陽(yáng)性表達(dá)。雙側(cè)乳腺癌首發(fā)癌和第二癌CA15-3表達(dá)同時(shí)陽(yáng)性有8例。同時(shí)陰性0例。原發(fā)性雙側(cè)乳腺癌首發(fā)癌和第二癌CK5/6表達(dá)同時(shí)陽(yáng)性有6例。同時(shí)陰性1例。

注：A：乳腺癌組織HE染色；B：CA15-3陽(yáng)性對(duì)照?qǐng)D；C：CK5/6陽(yáng)性對(duì)照?qǐng)D；D：PBS代替一抗陰性對(duì)照?qǐng)D；E： CA15-3在雙側(cè)乳腺癌首發(fā)癌的陽(yáng)性表達(dá)；F：CA15-3在雙側(cè)乳腺癌第二癌的陽(yáng)性表達(dá)；G：CA15-3在單側(cè)乳腺癌的陽(yáng)性表達(dá)；H：CK5/6在雙側(cè)乳腺癌首發(fā)癌的陽(yáng)性表達(dá)；I：CK5/6在雙側(cè)乳腺癌第二癌的陽(yáng)性表達(dá)；J：CK5/6在單側(cè)乳腺癌的陽(yáng)性表達(dá)

圖1 圖A為乳腺癌組織HE染色，×400 圖B-J免疫組化法（Envision法），×400

2.2 CA15-3和CK5/6在雙側(cè)乳腺癌和單側(cè)乳腺癌的表達(dá)

雙側(cè)乳腺癌首發(fā)癌和第二癌CA15-3表達(dá)同時(shí)陽(yáng)性有8例。同時(shí)陰性0例。雙側(cè)乳腺癌首發(fā)癌和第二癌CK5/6表達(dá)同時(shí)陽(yáng)性有6例。同時(shí)陰性1例。CA15-3和CK5/6在10例單側(cè)乳腺癌的表達(dá)率分別為9/10（90%）和8/10（80%）可見(jiàn)雙側(cè)乳腺癌首發(fā)癌和第二癌絕大多數(shù)CA15-3和CK5/6的蛋白表達(dá)一致，并且與單側(cè)乳腺癌的表達(dá)沒(méi)有明顯差別。即雙側(cè)乳腺癌的兩側(cè)癌可能來(lái)源于同一乳腺癌干祖細(xì)胞。

3 討論

腫瘤標(biāo)志物是繼影像學(xué)診斷和病理診斷之后最常用的腫瘤診斷方法之一。CA15-3為癌抗原，是乳腺細(xì)胞上皮表面糖蛋白變異體，對(duì)乳腺癌有明顯的器官特異性，對(duì)乳腺癌的早期診斷和術(shù)后療效檢測(cè)均有十分重要的臨床價(jià)值。是監(jiān)測(cè)乳腺癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)的最佳指標(biāo)，其含量變化與治療結(jié)果相關(guān)[6]。細(xì)胞角蛋白（CKs）來(lái)源于上皮組織，由20個(gè)成員組成，CK5/6是其中的一個(gè)成員，是一種基底細(xì)胞型角蛋白[7]。CK5/6是表達(dá)與basal-like表型乳腺癌中的一個(gè)特征性標(biāo)志物，是乳腺癌獨(dú)立的預(yù)后指標(biāo)[8]。用CA15-3和CK5/6聯(lián)合檢測(cè)原發(fā)性雙側(cè)乳腺癌首發(fā)癌和第二癌的表達(dá)差異，更具有臨床研究意義。

乳腺癌是一個(gè)成對(duì)的器官容易受到相同的環(huán)境和激素的影響。乳腺可以比作一對(duì)“雙胞胎”。關(guān)于雙胞胎的研究是假定單卵雙胎是完全一樣的，在單卵雙胎和異卵雙胎之間比較一些特征和疾病的一致性首先要承認(rèn)遺傳因素和環(huán)境因素的影響[8]。本實(shí)驗(yàn)研究表明，大部分原發(fā)性雙側(cè)乳腺癌是在絕經(jīng)前發(fā)病，通過(guò)運(yùn)用免疫組化來(lái)檢測(cè)左右兩癌的蛋白表達(dá)差異。表明原發(fā)性雙側(cè)乳腺癌首發(fā)癌和第二癌CA15-3和CK5/6的表達(dá)相似，說(shuō)明兩癌可能來(lái)源于同一乳腺癌干祖細(xì)胞。原發(fā)性雙側(cè)乳腺癌首發(fā)癌和單側(cè)乳腺癌之間的蛋白表達(dá)亦無(wú)差異，表明CA15-3和CK5/6在雙側(cè)乳腺癌和單側(cè)乳腺癌的表達(dá)無(wú)區(qū)別，雙側(cè)乳腺癌的惡性程度和單側(cè)乳腺癌的惡性程度相似。雖然乳腺是成對(duì)器官，但乳腺的成長(zhǎng)來(lái)自各自的原始乳芽。在成長(zhǎng)過(guò)程中雙側(cè)乳腺易受到類(lèi)似的遺傳因素、環(huán)境因素和激素的影響。有蛋白表達(dá)就一定有相應(yīng)的基因，而有基因不一定存在蛋白表達(dá)。左右兩側(cè)乳腺癌蛋白表達(dá)相似，應(yīng)該有相同的基因，進(jìn)一步表明兩個(gè)癌灶可能來(lái)源于同一癌細(xì)胞。

我們的研究表明70-90﹪雙側(cè)乳腺癌左右兩側(cè)癌有一致病理類(lèi)型和蛋白表型特征，說(shuō)明雙側(cè)乳腺癌的首發(fā)癌和第二癌是單克隆來(lái)源。而有極少部分表型不一致，可能是因?yàn)樵诎┰畹纳L(zhǎng)過(guò)程中發(fā)生了基因突變，從而導(dǎo)致蛋白表達(dá)有相差性。因此，我們接下的研究是從組織中提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄成CDNA，經(jīng)上下游引物擴(kuò)增需要的產(chǎn)物并測(cè)序，分析CA15-3和CK5/6基因在雙側(cè)乳腺癌左右兩癌有無(wú)相同的突變位點(diǎn)。

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作者簡(jiǎn)介：

劉勤，男，住院醫(yī)師，1982年12月01日 碩士學(xué)位 目前主要從事臨床甲狀腺乳腺外科 研究方向?yàn)槿橄侔?/p>

楊偉明，男，三級(jí)教授，主任醫(yī)師 學(xué)士學(xué)位 主要從事臨床甲狀腺乳腺工作，研究方向?yàn)槿橄侔?/p>