植物過氧化物酶同工酶的研究進展

顧雯雯 胡亞婷 韓英 卞涵佳 羅兵 孫海燕 萬能 楊志剛 沈宗根

摘要 過氧化物酶（Peroxidase，POD）是植物體內廣泛存在的氧化還原酶，在植物體內具有多種同工酶。POD同工酶具有種屬、器官以及發(fā)育階段特異性。它作為遺傳標記廣泛應用于植物的品種鑒定、遺傳多樣性分析、植物抗病性分析等方面。該研究綜述了植物POD同工酶檢測技術的研究進展以及POD同工酶的應用，提出進一步研究植物POD同工酶的建議。

關鍵詞 植物;過氧化物酶同工酶;研究進展

中圖分類號 S188 ?文獻標識碼 A ?文章編號 0517-6611（2014）34-12011-03

Research Progress of Peroxidase Isozymes in Plants

GU Wenwen1， HU Yating2， HAN Ying3， LUO Bing1* et al

（1. College of Biology and Food Engineering， Changshu Institute of Technology， Changshu， Jiangsu 215500; 2. Suzhou Wuyuetian Organic Agriculture Science and Technology Co. Ltd.， Wujiang， Jiangsu 215216; 3. Wujiang Pingwang Battle Companion Grape Professional Cooperatives， Wujiang， Jiangsu 215221）

Abstract The peroxidase （POD）， existed widely in plants， was an oxidoreductase and had various isozymes. The peroxidase isozymes had specificity in species， organs and developmental stage. As a genetic mark， the peroxidase isozymes were widely used in varieties identification， genetic diversity analysis， disease resistance. This paper reviewed the advances of detecting method for analysis of peroxidase isoenzymes in plants and the application of peroxidase isozymes. Suggestions were put forward for the further research of peroxidase isozymes in plants.

Key words Plants; Peroxidase isozymes; Research progress

基金項目 江蘇省青年基金項目（BK20140417）;蘇州市科技計劃項目（SZS201102，SYN201110，SNG201323和SNG201242）;江蘇省大學生實踐創(chuàng)新訓練計劃項目（201310333032Y）;蘇州市吳江區(qū)科技計劃項目（WN201311，WN201317）;常熟市科技計劃項目（CS201205）。

作者簡介 顧雯雯（1992- ），女，江蘇蘇州人，本科生，專業(yè)：植物生物化學。*通訊作者，副教授，博士，從事植物生物化學與分子生物學方面的研究。

收稿日期 20141024

過氧化物酶（Peroxidase，POD）是植物體內廣泛而大量存在的、活性較高的一種氧化還原酶。它能催化植物體內多種反應，參與光合作用、呼吸作用、抗病作用、植物生長等眾多生理活動。POD在植物體內具有多種同工酶。在植物不同的組織器官、不同的生長發(fā)育時期、不同的生理狀態(tài)（如病蟲害、逆境脅迫等）和不同品種中，POD同工酶的活性和數目變化都很大。POD同工酶能夠在很大程度上反映植物生長發(fā)育的特點、生物代謝狀況、適應外界環(huán)境能力以及品種之間的遺傳差異[1]。POD同工酶的電泳圖譜在一定條件下比較穩(wěn)定，并且與形態(tài)學性狀指標一樣具有種屬專一性。它作為遺傳標記已被廣泛應用于植物的品種鑒定、遺傳多樣性分析、植物抗病性分析、植物生長發(fā)育分析等方面[2-3]。筆者對植物體內POD同工酶檢測技術的研究進展以及POD同工酶應用進行了總結，以期為開展該領域的進一步研究有一定的指導作用。

1 過氧化物酶同工酶檢測技術研究進展

1.1 非變性不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳

非變性不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳（Native PAGE）不易使蛋白質變性，也稱生物大分子天然狀態(tài)聚丙烯酰胺凝膠電泳。它基本不破壞蛋白質的天然構象以及亞基間的相互作用，因此它可以保持蛋白質生物活性。該方法由于沒有使蛋白質變性，在植物POD同工酶的檢測中應用最廣泛。謝莉等[4]利用Native PAGE技術分析了3份高粱品種及其F1代的過氧化物酶同工酶，結果顯示甜高粱和栽培高粱POD同工酶的酶譜類型相近，而二者的酶譜比擬高粱的酶譜少1條帶;雜交F1 代POD同工酶的酶譜既有互補雙親酶帶的“互補帶”POD1，又有新的“雜合帶”POD4，但未表達出雙親共有的酶帶POD6。劉鵬等[5]也采用該方法對10份蓖麻的POD同工酶進行了分析，確定矮化蓖麻的特征譜帶為相對遷移率最小的譜帶，POD同工酶酶帶的多少能夠鑒別蓖麻的高矮類型。該方法在苦豆子和狼牙刺等植物材料中也被用于POD同工酶的檢測[6]。但，該方法分辨率較低，酶帶模糊且較寬，對同源性較高同工酶的分離能力很差。

1.2 復性電泳

復性電泳（Sodium dodecylsulfategelatinpolyacrylamide gel electrophoresis，GPAGE）是在20世紀80年代初建立起來的一種電泳技術，是一種電泳后仍然保持酶生物活性的電泳。它與非變性不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳的區(qū)別，主要是先用十二烷基磺酸鈉（SDS）將蛋白質變性，電泳結束后利用非離子去垢劑（如tritonX100）洗去蛋白質結合的SDS，使酶恢復生物活性[7]。姬生棟等[8]利用復性電泳技術（GPAGE）對小麥POD同工酶進行了研究，結果表明該技術能檢測小麥植物中POD同工酶，并且不同生育期小麥葉片中POD同工酶的種類和活性都不同。廖海等[9]利用復性電泳技術在5份菖蒲材料上成功檢測了POD同工酶，結果表明該方法比PAGE同工酶電泳分析方法具有酶帶邊界清晰、分離效果更好、試驗條件容易掌握等優(yōu)點。

1.3 十二烷基磺酸鋰不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳

十二烷基磺酸鋰不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳（LDSPAGE）中十二烷基磺酸鋰（LDS）對蛋白質的變性作用比SDS低。該電泳技術與GPAGE的主要區(qū)別就是電泳后不需要酶復性步驟。該技術在分離動物和細菌的血紅素蛋白中效果都較好[10-11]。王爽等[12]利用LDSPAGE技術對高粱和甘藍型油菜的POD同工酶進行了研究，在高粱和油菜中分別檢測到8、7條POD同工酶條帶，并且發(fā)現LDSPAGE技術比GPAGE技術靈敏。盡管如此，還有待于進一步研究該方法的具體操作步驟。

1.4 等電聚焦電泳

等電聚焦電泳（Isoelectric focusing electrophoresis，IFE）與以上電泳最主要的區(qū)別是要利用兩性電解質在凝膠內制造一個pH梯度。電泳時，每種蛋白質將遷移到的位置是與其等電點（pI）相等的pH處。邱竟等[13]利用等電聚焦電泳對棉花不育系進行研究時，棉花質核雄性不育系、保持系、恢復系的子葉、真葉、莖、花藥等組織在pH 4～6成功檢測到20種不同的過氧化物酶同工酶帶。周楠等[14]利用等電聚焦電泳技術分別在四倍體和二倍體棉屬植物中檢測到POD同工酶，并且棉屬種間的酶譜關系與形態(tài)學、細胞學和遺傳學的研究結果基本一致。徐建龍[15]利用等電聚焦電泳技術也成功地對水稻細菌性條斑病抗性中的POD同工酶進行了測定，結果顯示抗病親本和雜交后代的POD同工酶譜帶盡管有差異，在等電點pI 4.2～6.2之間都能檢測到POD同工酶。

1.5 過氧化物酶的染色方法

POD的染色方法有很多，但染色基本原理都一樣。 POD主要是利用H2O2氧化供氫物質，如果供氫體被氧化后生成有色沉淀，酶活性區(qū)就會發(fā)生呈色反應。POD對H2O2的專一性非常高，但對供氫體沒有嚴格要求。因此，供氫體不同，其染色配方就不同，并且供氫體相同時，染色液的配方比例和輔助添加試劑也可以不同，從而形成不同的染色方法。已有很多研究將聯苯胺、鄰聯太茴香胺、愈創(chuàng)術酚、香酚、3氨基9乙基咪唑等試劑作為供氫體，其中聯苯胺應用最廣泛[1-2，5，12-14]。在以聯苯胺為供氫體時，輔助添加物還可加不同的試劑如抗壞血酸（Vc）、NH3Cl和醋酸等。程東升等[16]研究顯示，酶帶檢測的靈敏性順序為NH3Cl-聯苯胺法> 聯苯胺法>愈創(chuàng)術酚法和Vc聯苯胺法>飽和聯苯胺法。王秀芬[17]卻認為，染色效果最好的是醋酸-聯苯胺染色液，抗壞血酸-聯苯胺染色液次之，染色效果最差的是聯大茴香胺染色法。

2 過氧化物酶同工酶應用的研究進展

2.1 POD同工酶在鑒別品種上的應用

POD同工酶酶譜具有種屬特異性。POD同工酶酶譜的差異能客觀地反映物種間的遺傳。利用POD同工酶對物種進行輔助鑒定，是一種比較簡單、有效的手段。劉紅燕[18]構建了鬼針草屬6種植物的POD同工酶PAGE指紋圖譜，結果顯示構建的POD同工酶PAGE指紋圖譜能把金盞銀盤（Bidens biternata Merr.et Scherff）、矮狼杷草（Bidens tripartita L.var.repens（D.Don.）Sherff）、鬼針草屬大狼杷草（Bidens frondosa L.）、小花鬼針草（Bidens parviflora Willd.）、狼杷草（Bidens tripartita L.）、婆婆針（Bidens bipinnata L.）等6種鬼針草屬植物一一區(qū)別開。趙曉平等[19]研究表明，利用POD同工酶能夠區(qū)分、鑒別加拿大楊、天楊、新疆楊、河北楊、小葉楊等5種楊樹。張春等[20]在分析泥炭蘚屬植物的POD同工酶時，發(fā)現POD同工酶能將加薩泥炭蘚和尖葉泥炭蘚區(qū)分、鑒別出來，但不能將泥炭蘚、多紋泥炭蘚和卵葉泥炭蘚區(qū)分開。馬玉花等[21]研究表明，POD同工酶的POD2譜帶僅出現在蘭果忍冬中，POD3譜帶僅出現在紅脈忍冬中，POD2和POD3可以用作鑒定上述2種植物的依據。

2.2 POD同工酶在不同組織之間的比較應用

研究表明，植株不同部位POD同工酶的譜帶有很大差異。由此可見，過氧化物酶存在著明顯的組織器官特異性。高勇等[22]對蘋果不同組織器官的POD同工酶進行了研究，發(fā)現花藥的酶譜比較穩(wěn)定，而隨著果實的發(fā)育，果肉中POD同工酶譜帶逐漸減少，酶活性逐漸降低，胚珠的酶帶卻逐漸增多，酶活性增強。全妙華等[23]也分析了四棱豆不同節(jié)位葉片、各器官的POD同工酶，結果顯示POD同工酶譜帶在各組織器官中的分布具有明顯的器官特異性，而成熟葉片中的分布在不同節(jié)位都很穩(wěn)定。孫丹等[24]研究發(fā)現，平貝母在組織培養(yǎng)過程中，各培養(yǎng)體不同發(fā)育時期的POD同工酶譜帶在形成小鱗莖后比較穩(wěn)定，而且酶譜帶數最多，為8條;在Rf為0.275處，愈傷組織出現了特異性譜帶，而培養(yǎng)體在其他時期沒有出現此帶，并且在剛形成小鱗莖時其活性也達最高，說明平貝母的過氧化物酶參與鱗莖的形成與發(fā)育。

2.3 POD同工酶在分析植物間親緣關系的應用

POD同工酶是單基因控制。POD同工酶酶譜的差異能夠反映基因所處的遺傳背景差異。趙沙沙等[25]利用POD同工酶分析了黃金冠、錦繡、錦黃2號、黃桃l9、錦黃4號和錦黃3號6個黃桃品種（品系）之間的遺傳親緣關系，結果表明錦繡與黃金冠之間的POD同工酶酶譜最相似，遺傳親緣關系最近，它們與其他4個品系間的遺傳親緣關系則較遠。區(qū)炳慶等[26]利用POD同工酶對南瓜屬6個不同品種進行了親緣關系分析，結果表明龍鳳瓜和珠瓜遺傳親緣關系最近;觀南l 7和早自矮遺傳親緣關系最近;魚翅瓜與觀南l 7、早自矮遺傳親緣關系較近，與龍鳳瓜、珠瓜的遺傳親緣關系則較遠;大南瓜與觀南l 7、早自矮遺傳親緣關系較近。張光花等[27]利用POD同工酶分析了胡蔥、洋蔥和蔥的親緣關系，發(fā)現胡蔥與洋蔥的遺傳親緣關系比較近，而胡蔥與大蔥的親緣關系相對較遠。夏齊平等[28]利用POD同工酶對石蒜屬種間和石蒜居群間進化關系進行了研究，結果顯示忽地笑與中國石蒜之間的遺傳親緣關系最近。這與細胞學和形態(tài)學的研究結果都很接近。另外，POD 同工酶的研究結果還表明，石蒜居群間遺傳距離與地理距離沒有相關性存在。

2.4 POD同工酶在分析植物抗性的應用

眾多的研究表明，過氧化物酶參與植物的抗病、抗蟲、抗鹽、抗旱以及抗生物脅迫等生理反應。朱友林等[29]研究了玉米抗大斑病菌基因與過氧化物酶同工酶的關系，發(fā)現POD活性及其同工酶電泳圖譜，在同一遺傳背景中不同抗病和感病品系間差異小，而在不同遺傳背景間差異大，說明POD活性和POD同工酶酶譜在抗病過程中的變化與抗病基因所處的遺傳背景關系十分密切。 徐建龍[15]研究了水稻細菌性條斑病抗性與POD同工酶的關系，結果表明細菌性條斑病對感病和抗病水稻葉片POD同工酶譜帶的影響不同，二者在等電點為4.2～5.3之間的酶帶差異最大，說明細菌性條斑菌能誘導POD等位基因的表達，最終呈現為POD同工酶譜帶的變化。馬峙英等[30]對POD同工酶與棉花黃萎病抗性的關系也進行了研究，顯示海島棉的PODPC1酶帶基因和海島棉對黃萎病的抗性都是顯性單基因遺傳，并且PC1酶帶的表現與棉株對黃萎病抗性能力呈顯著相關，PC1條帶如果弱，則棉株具有抗病性，反之PC1酶帶若強，則棉株易感病，從而證明POXPC1同工酶可能與棉花品種抗黃萎病有關。史學群等[31]在研究橡膠樹抗炭疽病的試驗結果與馬峙英等[30]研究結果有一些差異。在接種炭疽病后，抗性品系橡膠樹POD同工酶有新的酶帶產生，條帶顯色也較快，高感品系橡膠樹沒有產生新的酶帶。大麥、油菜上的研究也表明，POD同工酶與抗黃花葉病有密切關系[32]。

2.5 POD同工酶在分析種子純度的應用

POD同工酶用于種子純度的研究已有很多報道，但其分析結果不穩(wěn)定。周敏等[33]利用POD同工酶檢測花生“汕油523”的種子純度，并且發(fā)現與大田檢測結果基本一致。梅德圣等[34]利用POD同工酶對油菜種子純度進行了鑒定，結果顯示母本6098A比父本R5和雜種F1 少一條遷移率（Rf）為0.41的條帶。該特征條帶用來鑒定雜種純度時比較粗放，不能鑒定出父本雜株。馬國斌[35] 利用淀粉凝膠電泳技術對西瓜雜交種無籽西瓜“黑蜜二號”、“西農八號”及其父母本苗期子葉的POD同工酶進行了分析，結果顯示雜交種及其父母本間的POD同工酶酶譜均有差異，在“西農八號” 12 d苗齡的子葉和“黑蜜二號” 5 d苗齡的子葉中其POD同工酶酶譜的差異最明顯，鑒定種子純度的結果與田間鑒定的結果吻合。而黃永紅等[36-37]都不能利用POD同工酶對雜交西瓜的種子純度進行檢測。

3 展望

來源相同、催化性質相同而分子結構有差異的一類酶蛋白分子稱為同工酶。同工酶在生物界中廣泛存在，具有明顯的種屬、發(fā)育階段和組織器官的特異性，是生物體一種重要的生理指標，也是生物體可靠的遺傳標記。高等植物中過氧化物酶同工酶廣泛而大量地存在。它參與植物的光合作用、呼吸作用、生長發(fā)育、抗病蟲害、抗逆境脅迫等。POD同工酶的差異在一定程度上反映植物個體之間基因的差異。分析POD同工酶，可將表觀的遺傳特性與微觀的分子基礎緊密地聯系起來。由于POD是單基因控制，POD同工酶在很大程度上反映種、品種間的遺傳物質差異[1]，因此把它用作鑒定種、品種的一種指標，具有很好的參考價值;另外，在種質資源遺傳親緣關系的研究方面，它比形態(tài)學指標更能準確地反映其遺傳背景的差異。

為深入了解植物過氧化物酶同工酶，今后要進一步加強植物過氧化物酶同工酶檢測技術的研究，同時要更廣泛地擴展過氧化物酶同工酶的應用領域，為各種研究和生產服務。

42卷34期

顧雯雯等 植物過氧化物酶同工酶的研究進展

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