玉米秸稈纖維素降解菌的分離及發(fā)酵條件優(yōu)化

向殿軍　滿麗莉　張春鳳等

摘要[目的]研究玉米秸稈纖維素降解菌的分離與產(chǎn)酶條件。[方法]從富含腐爛玉米秸稈的土壤中分離篩選到1株能降解纖維素的真菌C01，經(jīng)形態(tài)觀察和ITS序列分析，初步鑒定該菌種，并對該菌產(chǎn)酶條件進(jìn)行優(yōu)化。[結(jié)果]玉米秸稈纖維素降解真菌最佳接種種齡5 d，培養(yǎng)液初始pH為5，接種量12%；培養(yǎng)時間5 d的優(yōu)化條件下，酶活力達(dá)1.76 IU/ml。該菌株對玉米秸稈降解效果較好，優(yōu)化條件下，7 d降解率達(dá)66.8%。[結(jié)論]該研究可為提高玉米秸稈的利用率提供優(yōu)質(zhì)的菌種資源。

關(guān)鍵詞玉米秸稈；纖維素降解；分離；產(chǎn)酶條件

中圖分類號S181.3文獻(xiàn)標(biāo)識碼A文章編號0517-6611（2014）04-01159-03

基金項目牡丹江市科學(xué)技術(shù)計劃項目（玉米秸稈纖維素降解菌的選育及應(yīng)用研究，G2013n0012）的階段性研究成果。

作者簡介向殿軍（1978-），男，黑龍江望奎人，講師，博士，從事農(nóng)業(yè)基礎(chǔ)研究。*通訊作者，講師，博士，從事食品基礎(chǔ)研究。

纖維素是構(gòu)成植物細(xì)胞壁的主要成分，占植物干重的1/3～1/2，全球一年間由光合作用生產(chǎn)的纖維素約1.5×109 t[1-2]。我國是一個農(nóng)業(yè)大國，每年的秸稈產(chǎn)量約7.0億t，其中玉米秸稈占2.2億t[3]。纖維素中由于存在許多高能的氫鍵，因此其水解、利用均很困難，89%的秸稈以堆積、荒燒等形式直接傾入環(huán)境，造成極大的污染和浪費。秸稈還田可補充土壤有機質(zhì)，維持土地利用的物質(zhì)平衡，利于農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展，是降解秸稈的一種良好途徑。相對于間接還田方式，玉米秸稈原位還田可減輕勞動強度，節(jié)省成本，已經(jīng)在農(nóng)區(qū)廣為推廣應(yīng)用。然而，我國北方地區(qū)玉米收獲、秸稈還田是在深秋時節(jié)，由于氣候干燥、溫度偏低，原位還田的玉米秸稈自然腐解速度緩慢，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來許多不利影響，導(dǎo)致秸稈還田應(yīng)用阻力較大，應(yīng)用面積小，配施適當(dāng)?shù)慕斩捊到饩鷦┦墙鉀Q該問題的有效方法[4-5]。但目前纖維素酶生產(chǎn)菌株的酶活力不高，因此篩選高活力的纖維素酶生產(chǎn)菌株是開展秸稈原位還田和堆漚還田的一個關(guān)鍵前提。該研究從常年堆積玉米秸稈的土壤中篩選到1株高纖維素酶活的纖維素降解真菌，通過分子生物學(xué)手段對其進(jìn)行了鑒定，并對其產(chǎn)酶條件進(jìn)行了初步研究， 以期為提高玉米秸稈的利用率提供優(yōu)質(zhì)的菌種資源和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品。土壤樣品采集自牡丹江市郊區(qū)玉米秸稈堆積處。玉米秸稈為成熟玉米秸稈地上部分，曬干、粉碎過80目篩備用。

1.1.2培養(yǎng)基。玉米秸稈篩選培養(yǎng)基：2%玉米秸稈粉，0.3% NaNO3，0.1%KH2PO4，0.05%MgSO4·7H2O，0.05%KCl，0.001%FeSO4，2%瓊脂，自然pH。羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）培養(yǎng)基：1%CMC-Na，0.3%NaNO3，0.1%KH2PO4，0.05%MgSO4·7H2O，0.05%KCl，0.001%FeSO4，2%瓊脂，自然pH。種子培養(yǎng)基：20%馬鈴薯，2%蔗糖，自然 pH，固體培養(yǎng)基加入2%瓊脂。液體發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基：0.75%玉米秸稈粉，0.75%麩皮，0.5%（NH4）2SO4，0.1%KH2PO4，0.05%MgSO4·7H2O，0.5%蛋白胨。

1.2試驗方法

1.2.1 纖維素分解單菌株的篩選。將玉米秸稈堆腐樣品按適當(dāng)梯度稀釋后接種至玉米秸稈篩選培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)3 d進(jìn)行增殖，挑取單菌落經(jīng)3次平板劃線分離培養(yǎng)獲得純菌落，點接種于CMC-Na平板上，用1 mg/L剛果紅溶液染色1 h，再用1 mol/L 的NaCl溶液洗脫1 h后，測水解圈直徑。根據(jù)D值（D=水解圈直徑/天數(shù)）的大小進(jìn)行初篩。將初篩的菌株接種于種子培養(yǎng)基中，30 ℃，180 r/min震蕩培養(yǎng)5 d，然后接種到液體發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，30 ℃，180 r/min震蕩培養(yǎng)5 d，測定羧甲基纖維素酶（CMCase）活力，選取酶活最高的菌株試管斜面保存?zhèn)溆?，作為進(jìn)一步研究的對象。

1.2.2 酶活測定。取發(fā)酵液于4 ℃、4 000 r/min離心10 min，收集上清液即得粗酶液。按宋穎琦等[6]試驗方法進(jìn)行CMC酶活力測定。

1.2.3菌株形態(tài)和ITS序列鑒定。將菌株接種到平板上，培養(yǎng)3 d，觀察菌落的特征。在平板上挑菌體少許，涂于載玻片上，染色后置于顯微鏡下觀察，參照《真菌鑒定手冊》對其進(jìn)行形態(tài)分析與鑒定。采用CTAB 法提取菌株C01的總DNA[7]，設(shè)計ITSf（5′-CACGGCTCTACCTGATCGAGGTCAC-3′）和ITSr（5′-CTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGG-3′）引物，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增其ITS片段，產(chǎn)物經(jīng)TA克隆后測序。將獲得的片段進(jìn)行Blast分析，確定與其親緣關(guān)系最近的種屬，并從數(shù)據(jù)庫獲得相關(guān)種屬的ITS序列，利用CLUSTAL X和MEGA4.1軟件，采用臨近法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并進(jìn)行1000 bootstrap檢測。

1.2.4 產(chǎn)酶條件優(yōu)化。在250 ml錐形瓶中進(jìn)行液體發(fā)酵，依次改變種齡（1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d、7 d）、培養(yǎng)基初始pH（3、4、5、6、7、8、9）、接種量（3%、6%、9%、12%、15%、18%、21%）及發(fā)酵時間（1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d、7 d）中的某一因素，并保持其他發(fā)酵條件不變，通過測定CMCase活性，研究各因素對產(chǎn)酶的影響。

1.2.5 不同秸稈發(fā)酵試驗。保持氮源和發(fā)酵條件不變，分別用玉米秸稈、小麥秸稈、水稻秸稈作為碳源發(fā)酵7 d，研究菌株C01對其降解效果。

2 結(jié)果與分析

2.1菌株篩選通過剛果紅透明圈法初篩出 6株形態(tài)不同的纖維素降解真菌（圖1），分別命名為C01～C06，其中C01、C03水解圈生成速度較快，說明分解纖維素類物質(zhì)的能力較強（表1）。在相同培養(yǎng)條件下，對所有初篩菌株進(jìn)行纖維素酶活測定，其中菌株C01的CMC酶活為1.52 IU/ml，高于其他菌株，因此選定C01作為進(jìn)一步研究對象（表1）。

2.2菌株鑒定菌株C01在CMC-Na培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)呈圓形，邊緣平整有白色菌絲，表面粗糙，初期為白色，后期因分生孢子的產(chǎn)生而呈深綠色，布滿一層分生孢子粉（圖2）。在油鏡下可以看到，菌絲有隔膜，分生孢子梗光滑，多呈橢圓形或球形，不對稱分支2～5個，排列緊密，呈兩輪生的掃帚狀，分生孢子呈圓形或橢圓形（圖3）。根據(jù)菌落形態(tài)觀察和鏡檢結(jié)果，參照《真菌鑒定手冊》，初步判斷菌株C01為青霉屬。

培養(yǎng)液初始pH也是影響羧甲基纖維素酶活的一個主要因素。當(dāng)培養(yǎng)液初始pH為5～6時，菌株C01的酶活較大（表2），而后隨著pH的升高，酶活不斷下降，表明C01纖維素酶系偏酸性。

接種量對酶活性的影響比較小，由表2可知，隨著接種量的增加，酶活力增大，即菌株產(chǎn)酶能力增強，當(dāng)接種量為12%時，酶活力最高，接種量超過12%后，酶活力變化不大，略有下降。

菌株C01的羧甲基纖維素酶活隨著發(fā)酵時間的延長，呈現(xiàn)先增后降的趨勢，在第5天時達(dá)到最大值（表2），隨后降低，可能菌體出現(xiàn)老化，產(chǎn)生的蛋白酶影響了羧甲基纖維素酶活，此外，反應(yīng)過程中產(chǎn)生的纖維素二糖、葡萄糖也能對酶解反應(yīng)形成反饋抑制。

2.4菌株C01對各種秸稈的降解率 對各種秸稈的降解效果研究表明，菌株C01對秸稈纖維素具有高效降解作用（表3）。其中對玉米秸稈的降解轉(zhuǎn)化率最高，降解率達(dá)到66.8%，分別為水稻秸稈和小麥秸稈降解率的1.21和1.25倍，這可能是由于篩選環(huán)境為玉米秸稈堆積土壤的原因。

3結(jié)論

從常年堆積玉米秸稈的土壤中篩選到6株產(chǎn)纖維素酶的真菌，通過測定羧甲基纖維素酶活得到纖維素酶活最高的菌株C01。對該菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)和ITS分子生物學(xué)鑒定，確定其為青霉屬。對C01產(chǎn)酶條件進(jìn)行了初步研究，確定該菌株最佳產(chǎn)酶條件為：接種種齡5 d，培養(yǎng)液初始pH 5，接種量12%，培養(yǎng)時間5 d，在此條件下，其酶活力達(dá)1.76 IU/ml。該研究篩選到的C01菌株酶活較高，有一定的應(yīng)用價值，可為下一步玉米秸稈降解的實際應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

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[6] 宋穎琦， 劉睿倩， 楊謙， 等. 纖維素降解菌的篩選及其降解特性的研究[J]. 哈爾濱工業(yè)大學(xué)學(xué)報， 2002， 34（2）： 197-200.