韭菜粗提取物對柑橘青霉菌的抑菌效果研究

畢璋友　吳惠君

摘要[目的]研究韭菜乙醇粗提物對儲藏期柑橘青霉病菌的抑菌作用。[方法]采用粗提物濃度梯度的平板培養(yǎng)法培養(yǎng)柑橘青霉菌，判斷不同溶劑和不同處理的粗提物對柑橘青霉菌是否有抑制作用。[結(jié)果]以酒精、丙酮和無菌水為溶劑的新鮮韭菜提取物對柑橘青霉菌都有不同程度的抑制作用，且隨著濃度的增大抑菌作用增強(qiáng)，隨著培養(yǎng)時間的延長抑菌作用降低；以無菌水為溶劑的藥液抑制作用最大，24 h時EC50為431.385 μg/ml。以無菌水為溶劑時，不同處理方法所得的韭菜乙醇粗提取物對柑橘青霉菌菌絲生長有明顯的抑制作用，以新鮮莖葉對菌絲生長的抑制作用最大，干根次之，以干莖葉的抑制作用最小。[結(jié)論]韭菜乙醇粗提物對儲藏期柑橘青霉病菌的菌絲有抑菌作用。

關(guān)鍵詞韭菜提取物；柑橘青霉菌；抑菌率

中圖分類號S436.661.1文獻(xiàn)標(biāo)識碼A文章編號0517-6611（2014）04-01002-02

基金項目安徽省農(nóng)產(chǎn)品安全重點實驗室開放基金項目（2009Las01）。

作者簡介畢璋友（1963-），男，安徽池州人，教授，從事植物病害控制方面的研究與教學(xué)。

韭菜（Allium tuberosum）別名起陽草、長生韭、草鐘乳等，屬于百合科（Liliaceae）蔥屬（Allium）。韭菜中除含有蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物、胡蘿卜素及微量元素外[1]，還富含硫化物[2]、甾體皂苷[3-5]、氮化物[6]和黃酮類等生物活性物質(zhì)[7]。韭菜汁液及提取物具有殺蟲抑菌及抗突變等功效[8]。

柑橘貯運期間青霉病害是柑橘類果品發(fā)生最普遍、危害最嚴(yán)重的侵染性病害[9]，目前主要通過低溫貯藏和利用化學(xué)殺菌劑如咪鮮胺、苯甲酸、對羥基苯甲酸酯等對柑橘防腐保鮮，不僅增加貯藏成本，而且造成環(huán)境污染和果品中的農(nóng)藥殘留，食用后對人體損害很大[10]。因此，尋找安全、高效、無毒的生物防治方式控制柑橘類果品采后腐爛成為當(dāng)務(wù)之急。植物是生物活性化合物的天然寶庫，研究和尋找植物性化合物來保護(hù)果蔬貯藏期間免受病菌的侵染更加受到人們的重視。李亞蕾等[11]研究沙蔥提取物對酵母菌、青霉、黑曲霉、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌抑制作用，取得較佳的效果。張香美等[12]利用小根蒜提取物對香椿保鮮，能顯著降低香椿的腐爛率。喻林華等[13]發(fā)現(xiàn)銀杏葉乙醇提取物對柑橘青霉病菌具有較強(qiáng)的抑菌作用。關(guān)于韭菜提取物對果蔬貯藏期間防病保鮮的研究較少，筆者旨在探明韭菜乙醇提取物對柑橘青霉的抑制作用，為進(jìn)一步研究其化合物的類型以及開發(fā)和利用提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料與試劑韭菜：購于安慶職業(yè)技術(shù)學(xué)院周邊農(nóng)家，新鮮、無軟爛、無霉變，品種為平韭5號，營養(yǎng)生長期。

柑橘青霉病菌（Penicillium italicum）：安慶職業(yè)技術(shù)學(xué)院園林園藝系實驗室提供。

99.7%乙醇（上海中秦化學(xué)試劑有限公司）、99.7%丙酮（上海試劑廠）。

食物攪碎器（JLL30—B型，順德市希貴電器制造有限公司），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國IKA生產(chǎn)，RV1O型，配HB1O水浴鍋）。

1.2培養(yǎng)基馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基：馬鈴薯（切碎成塊）20 g，葡萄糖20 g，瓊脂15～20 g，水1 000 ml，pH自然。

1.3韭菜提取物的制備 取新鮮韭菜洗凈，晾干，稱取200 g放入食物攪碎器中攪拌成菜泥；另分別取晾干的韭菜莖葉及韭菜根若干，放入70 ℃烘箱中烘干，取出干韭菜莖葉和干韭菜根各200 g放入上述食物攪碎器中攪拌，粉碎后密閉保存?zhèn)溆谩?/p>

將上述新鮮韭菜莖葉泥、干韭菜莖葉粉、干韭菜根粉各200 g分別放入裝有500 ml 99.7%乙醇的燒杯中浸漬，并于第3、5、7天提取過濾，將濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至乙醇揮發(fā)完全即得韭菜乙醇粗提取物，并將乙醇回收，放于冰箱中密閉冷藏備用。

1.4韭菜粗提取物對柑橘青霉菌的抑菌效果

1.4.1 不同溶劑的新鮮莖葉粗提物對柑橘青霉菌的抑制活性。以無水乙醇、丙酮和無菌水為不同溶劑溶解新鮮莖葉粗提物，配制成2.5、5.0、10.0、20.0和40.0 mg/ml的粗提物稀釋液。用無菌吸管分別吸取2 ml稀釋液加入到18 ml的PDA培養(yǎng)基中，充分混勻。同時設(shè)置不含粗提物的平板作為對照。待培養(yǎng)基冷卻凝固后，在平板上接種直徑5 mm的柑橘青霉菌菌碟，26 ℃靜置培養(yǎng)，分別于24、48、72和96 h各觀察1次，采用十字交叉法測量菌落直徑，每處理重復(fù)3次。

1.4.2 無菌水為溶劑的不同處理粗提物對柑橘青霉菌的抑制活性 。以無菌水為溶劑，將新鮮莖葉、干莖葉和干根乙醇粗提物配制成2.5、5.0、10.0、20.0和40.0 mg/ml的粗提物稀釋液。用無菌吸管分別吸取2 ml稀釋液加入到18 ml的PDA培養(yǎng)基中，充分混勻。同時設(shè)置不含粗提物的平板作為對照。待培養(yǎng)基冷卻凝固后，在平板上接種直徑5 mm的柑橘青霉菌菌碟，26 ℃靜置培養(yǎng)，分別于24、48、72和96 h各觀察一次，采用十字交叉法測量菌落直徑，每處理重復(fù)3次。

1.5數(shù)據(jù)分析 不同溶劑溶解的新鮮韭菜莖葉提取物和不同處理的粗提物對柑橘青霉菌的抑制率按下列公式計算：

抑菌率（%）=對照菌落直徑-處理菌落直徑對照菌落直徑-菌碟直徑×100

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度溶劑的新鮮莖葉粗提物對柑橘青霉菌的抑制作用由表1可知，在相同培養(yǎng)時間內(nèi)，隨著不同溶劑提取物濃度的增大，3種不同溶劑的新鮮莖葉粗提物對柑橘青霉菌的抑菌效果增強(qiáng)；隨著培養(yǎng)時間的延長，提取物對柑橘青霉菌的抑菌效果降低。3種溶劑的新鮮莖葉粗提物在培養(yǎng)24 h后對柑橘青霉菌的抑菌效果最好，提取物濃度為40 mg/ml時，抑菌率達(dá)到60%以上，隨著時間的延長，以酒精為溶劑的新鮮莖葉粗提物對柑橘青霉菌有較好的抑制作用。對24 h抑菌率（y）與新鮮莖葉粗提物濃度（x）進(jìn)行毒力回歸分析，以酒精、丙酮和無菌水為溶劑分別得到新鮮韭菜莖葉提取物EC50分別為1191.242、1163.729和431.385 μg/ml（表2），以無菌水為溶劑提取物對柑橘青霉菌抑制作用最好。

2.2無菌水為溶劑的不同處理粗提物對柑橘青霉菌的抑制作用由表3可知，在相同培養(yǎng)時間內(nèi)，不同處理粗提物的濃度與其對柑橘青霉菌的抑制效果成正比；在相同濃度不同處理的粗提物培養(yǎng)基上，隨著培養(yǎng)時間的延長，不同處理粗取物對柑橘青霉菌的抑菌效果降低。總體而言，隨著粗提物濃度的增大，新鮮莖葉對對柑橘青霉菌的抑制作用最大，干根次之，以干莖葉的抑制率最小。培養(yǎng)24 h其EC50分別為431.385、1 469.199和3 319.913 μg/ml（表4）。

3 小結(jié)與討論

柑橘是我國南方的主要水果之一，采收后常由于機(jī)械損傷、貯藏管理不當(dāng)或微生物的侵染而造成的損失為5%～20%，其中柑橘青霉菌引起的柑橘果實腐爛約占80%[14]。因此，控制柑橘青霉菌的侵染及發(fā)展，對于減少柑橘的采后腐爛具有積極作用。在環(huán)境保護(hù)日益受到重視的今天，植物源農(nóng)藥因具有無污染、不積累、取材容易、費用低廉等優(yōu)點，成為創(chuàng)新農(nóng)藥品種的主要途徑之一。

該研究采用藥物濃度梯度的平板培養(yǎng)法培養(yǎng)柑橘青霉菌，測定了韭菜乙醇粗提物對儲藏期柑橘青霉病菌的抑菌作用。發(fā)現(xiàn)不同溶劑韭菜乙醇粗提取物對柑橘青霉菌有不同程度的抑制作用，且隨著濃度的增大抑菌作用增強(qiáng)，隨著培養(yǎng)時間的延長抑菌作用降低。以無菌水為溶劑的藥液抑制作用最大，24 h時EC50為431.385 μg/ml。無菌水為溶劑的韭菜不同處理乙醇粗提物對柑橘青霉菌的抑制作用表現(xiàn)差異較大，以新鮮莖葉處理所得的粗提取物抑菌作用最強(qiáng)，其次是干根，以干莖葉處理所得的粗提取物抑菌作用最弱，說明韭菜乙醇粗提取物可能對溫度較敏感，長時間70 ℃的高溫對韭菜乙醇粗提取物的生物活性可能有破壞作用。

該研究采用乙醇作為浸提液，而其他有機(jī)物質(zhì)作為浸提液所提取的粗提物對柑橘青霉菌的抑制作用沒有涉及，是否有更好的效果有待以后進(jìn)一步的驗證。韭菜乙醇粗提取物的化學(xué)組成、有效毒理成分及毒理等問題也有待進(jìn)一步的研究。

參考文獻(xiàn)

[1] 張玲，時延增，徐新剛.韭菜籽中氨基酸及微量元素分析[J].時珍國藥研究，1999，7（1）：21.

[2] 衛(wèi)煜英，萬仁忠.韭菜揮發(fā)油主要成分的氣相色譜一質(zhì)譜分析[J].分析化學(xué)，1996，24（2）：192-194.

[3] 桑圣明，夏增華，毛土龍，等.中藥韭菜籽化學(xué)成分的研究[J].中國中藥雜志，2000，25（5）：286-288.

[4] ZOU Z M，YU D Q，CONG P Z.A ster oidal saponins from the seeds of Allium tuberosum[J].Phytochemistry，2001，57：1219-222.

[5] IKEDA T，TSUMAGARI H，NOHARA T.Steroidal oligoglycosides from the seeds of Allium tuberosum[J].Chem Pharm Bull（Tokyo），2000，48（3）：362-365.

[6] OOI LS，YU H，CHEN CM.Isolation and characterization of a bioactive mannosebinding protein from the Chinese chive Allium tuberosum[J].J Agric Food Chem，2002，50（4）：696-700.

[7] 趙慶華，吳東儒，李國賢，等.蔥屬植物韭子皂苷的化學(xué)結(jié)構(gòu)及其滅螺活性的研究[J].安徽大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，1993（4）：62-64.

[8] 王鴻梅，馮靜.韭菜揮發(fā)油中化學(xué)成分的研究[J].天津醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2002，8（2）：191-192.

[9] 虞軼俊，陳道茂，陳衛(wèi)民.新編柑橘病蟲害防治手冊[K].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2001.

[10] 陳召亮，王海宏，喬勇進(jìn).10%十二烷基芐基二甲基氯化銨水劑對柑橘青霉病和綠霉病的防治效果[J].農(nóng)藥研究與應(yīng)用，2010（2）：27-29.

[11] 李亞蕾，羅瑞明.沙蔥提取物抗菌效果的研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36（33）：14596-14597，14618.

[12] 張香美，趙鳳存，李慧荔，等.小根蒜提取物對香椿保鮮效果的影響[J].中國農(nóng)學(xué)通報，2009，25（4）：55-58.

[13] 喻林華，李曉烈，藍(lán)華，等.銀杏葉提取物對柑橘青霉病菌的抑菌效果[J].食品與機(jī)械，2010（6）：60-62.