中國(guó)小家鼠細(xì)胞色素b基因序列分析

徐健　靖美東　黃玲

摘要[目的]研究中國(guó)小家鼠的細(xì)胞色素b基因序列與DNA分類(lèi)系統(tǒng)。[方法]對(duì)來(lái)自陜西漢中、新疆烏魯木齊、云南昆明、湖北武漢和臺(tái)灣等18個(gè)地區(qū)的20只小家鼠個(gè)體進(jìn)行基因組DNA提取，細(xì)胞色素b基因的PCR擴(kuò)增和序列測(cè)定，并分析堿基組成，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。[結(jié)果] 20只小家鼠基因組大小均在20 000 bp以上；小家鼠細(xì)胞色素b基因序列中A、T、G、C的平均含量分別為31.6%、29.2%、12.2%和27.0%，個(gè)體間堿基組成幾乎無(wú)差別；漢中、烏魯木齊等長(zhǎng)江以北的12個(gè)個(gè)體與M.m.musculus的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系為一支系，昆明、武漢、臺(tái)灣等8個(gè)長(zhǎng)江以南的個(gè)體與M.m.castanues的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系較近。[結(jié)論]中國(guó)小家鼠以長(zhǎng)江為界，可分為南北2大亞種，南方為M.m.castanues亞種，北方為M.m.musculus亞種。

關(guān)鍵詞中國(guó)小家鼠；細(xì)胞色素b；系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

中圖分類(lèi)號(hào)S188文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2014）04-00989-03

基金項(xiàng)目國(guó)家自然科學(xué)基金（31371252）。

作者簡(jiǎn)介徐?。?987- ），女，山東德州人，碩士研究生，研究方向：細(xì)胞生物學(xué)。

小家鼠（Mus musculus）屬?lài)X目（Rodentia）鼠科（Muridae）小家鼠屬（Mus）動(dòng)物，是全球性分布的人類(lèi)共棲鼠類(lèi)，體型較小，夜出活動(dòng)，是生物進(jìn)化、遺傳學(xué)及生態(tài)學(xué)研究的理想研究模型。小家鼠作為重要的模式生物，和人類(lèi)關(guān)系密切。其生物地理模式與遺傳分化模式可能與人類(lèi)的遷徙、貿(mào)易聯(lián)系、文化接觸和移民活動(dòng)等直接相關(guān)[1]。對(duì)其起源和擴(kuò)散的研究可探討人類(lèi)的起源與擴(kuò)散[2]。此外，小家鼠還對(duì)糖尿病、眼疾等人類(lèi)疾病和免疫缺陷等醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域作出重要貢獻(xiàn)。雖然在過(guò)去30年里，研究者已經(jīng)在小家鼠的生物地理學(xué)和古生物學(xué)方面做了大量研究[3]，在物種的起源進(jìn)化和擴(kuò)散歷史問(wèn)題等方面積累了大量資料，但仍然有很多問(wèn)題尚不清楚。

自1758年林奈命名小家鼠起，各地對(duì)于小家鼠亞種的報(bào)道也不斷增多，但其鑒別依據(jù)較為簡(jiǎn)單粗略，因此有許多同物異名者。隨著分子生物學(xué)等技術(shù)引入小家鼠種群結(jié)構(gòu)的研究，許多學(xué)者進(jìn)一步對(duì)其分類(lèi)系統(tǒng)提出了修改。目前流行的觀點(diǎn)認(rèn)為，小家鼠包括3個(gè)亞種，分別是M.m.musculus，M.m.domesticus和M.m.castaneus[4]。其中，M.m.musculus分布在東歐和東北亞地區(qū)，M.m.domesticus分布在西歐、中東和北非地區(qū)，M.m.castaneus分布在東南亞和印度次大陸[3]。在過(guò)去的數(shù)百年里，M.m.domesticus已經(jīng)借由人類(lèi)活動(dòng)擴(kuò)散到了非洲、澳大利亞、南美、北美及許多海洋性島嶼。

我國(guó)疆域遼闊，地形地貌豐富，氣候狀況復(fù)雜，地理氣候環(huán)境的多樣性孕育了豐富的小家鼠遺傳資源。然而，一直以來(lái)針對(duì)中國(guó)小家鼠的系統(tǒng)地理學(xué)研究鮮有報(bào)道，有很多問(wèn)題仍不清楚。其中，中國(guó)小家鼠的分類(lèi)系統(tǒng)不明確。Ellerman和MorrisonScott記錄了至少5個(gè)亞種[5]。之后，Marshall根據(jù)地理分布和形態(tài)特征將中國(guó)小家鼠區(qū)分為3個(gè)主要的組群，而Tsuchiya等基于形態(tài)特征將其分成了6個(gè)亞種。Prager等進(jìn)行了線(xiàn)粒體DNA序列分析[6]，認(rèn)為中國(guó)內(nèi)蒙古和北京2個(gè)地區(qū)的標(biāo)本屬于M.m.musculus。然而，這些最初的基因研究只包含有限的樣本，所涉及的地理分布范圍不是很廣。因此，要想知道中國(guó)小家鼠的分類(lèi)系統(tǒng)，就必須要加大采樣范圍進(jìn)行更詳盡的研究。

線(xiàn)粒體細(xì)胞色素b基因能夠?yàn)榻沂窘忝梅N或相近種的親緣關(guān)系提供充分的信息[7]，因此是研究脊椎動(dòng)物分子系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的有效分子標(biāo)記[8]。劉曉明、羅靜等曾分別對(duì)中國(guó)西部的絨鼠屬和姬鼠屬的細(xì)胞色素b基因進(jìn)行過(guò)研究，進(jìn)一步證明了該基因作為屬內(nèi)水平分子系統(tǒng)發(fā)育的分子標(biāo)記的有效性[9-10]。筆者采集了18個(gè)地區(qū)的小家鼠樣品進(jìn)行試驗(yàn)，測(cè)定20個(gè)個(gè)體的細(xì)胞色素b基因的全序列，并將其與GenBank中下載的M.m.musculus（EF108342）、M.m.castaneus（EF108345）和Rattus norvegicus（X14848）的片段進(jìn)行比對(duì)分析，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，進(jìn)一步探討中國(guó)小家鼠亞種的分類(lèi)情況，以期為相關(guān)研究提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料陜西漢中、新疆烏魯木齊、云南昆明、湖北武漢和臺(tái)灣等18個(gè)采集地的20個(gè)小家鼠樣品（表1）。取新鮮的鼠尾組織于100%乙醇中帶至實(shí)驗(yàn)室，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2樣品的擴(kuò)增與測(cè)序剪取保存的小家鼠尾部組織，約綠豆粒大?。?.00 g左右），采用Promega試劑盒方法提取其基因組DNA。采用3對(duì)引物（表2），對(duì)長(zhǎng)度約為1.2 kb左右的細(xì)胞色素b基因片段進(jìn)行擴(kuò)增。用Takara公司生產(chǎn)的Premix Taq（TaKaRa TaqTM Version 2.0 plus dye）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增結(jié)果用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)濃度合適后由上海生工生物工程服務(wù)有限公司測(cè)序。

2結(jié)果與分析

2.1小家鼠基因組DNA提取結(jié)果將提取的小家鼠基因組DNA通過(guò)電泳檢測(cè)并通過(guò)UVP凝膠成像系統(tǒng)觀察，DNA大小均在20 000 bp以上，條帶整齊清晰，單一明亮，雖有少許降解，但不影響試驗(yàn)進(jìn)行。

2.2小家鼠基因組DNA PCR擴(kuò)增結(jié)果取5 μl PCR產(chǎn)物于1.5%的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳檢測(cè)，并通過(guò)UVP凝膠成像系統(tǒng)觀察，條帶整齊清晰，單一明亮，其余保存于4 ℃條件下，留待測(cè)序。

2.3DNA序列的堿基組成用Mega 5.2對(duì)所測(cè)序列進(jìn)行分析，結(jié)果表明，細(xì)胞色素b基因的A、T、G、C的平均含量分別為31.6%、29.2%、12.2%和27.0%。除作為外群的大家鼠（Rattus norvegicus，X14848）的堿基含量有些不同外，其余個(gè)體間堿基組成幾乎無(wú)差別（表3）。

2.4系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)圖1表明，大家鼠Rattus norvegicus（X14848）為外群，20個(gè)中國(guó)小家鼠個(gè)體分成2個(gè)大的分支。其中，HZ、YA、DT、CZ、UQ、HF、KZ、CY、SL、LY、BT和MH 這12個(gè)小家鼠個(gè)體與M.m.musculus（EF108345）小家鼠的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系較近，共享1個(gè)分支，在該分支中，UQ與HF、MH與CY、SL與DT兩兩分別具有相同的支長(zhǎng)。TW1、WH、PX、KM、TW2、TW3、GX和GZ這8個(gè)個(gè)體與M.m.castanues（EF108342）小家鼠的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系較近，共享1個(gè)分支，在該分支中，WH與PX、TW2與TW3、GX與GZ兩兩分別具有相同的支長(zhǎng)。

小家鼠作為一種重要的模式動(dòng)物，已經(jīng)在生物學(xué)、醫(yī)學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用，其本身存在的遺傳差異也引起了高度的重視[11]。

試驗(yàn)采用試劑盒方法提取小家鼠新鮮冰凍材料的基因組DNA，提取效果較好，用特異引物對(duì)基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果很好，上海生工生物公司對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序順利，結(jié)果很好，將測(cè)序得到的結(jié)果與GenBank中已有的小家鼠序列進(jìn)行比較，結(jié)果表明，擴(kuò)增和測(cè)序結(jié)果正確。

通過(guò)序列對(duì)比發(fā)現(xiàn)，20個(gè)中國(guó)小家鼠個(gè)體的細(xì)胞色素b基因長(zhǎng)為1 144 bp，其堿基序列及含量相差很小，A、T、G、C的平均含量分別為31.6%、29.2%、12.2%和27.0%；AT含量（60.8%）大于GC含量（39.2%），存在顯著的AT偏性，每個(gè)個(gè)體間堿基組成幾乎無(wú)差別。20個(gè)個(gè)體的1 144個(gè)堿基中，TW1、WH、PX、KM、TW2、TW3、GX、GZ這8個(gè)個(gè)體有18處堿基不同于HZ、YA、DT、CZ、UQ、HF、KZ、CY、SL、LY、BT和MH這12個(gè)個(gè)體；此外，還有極少數(shù)的幾個(gè)堿基序列不一致，其余均相同。

試驗(yàn)所用的小家鼠分別來(lái)自長(zhǎng)江以南，包括臺(tái)灣省在內(nèi)的6個(gè)地區(qū)，以及長(zhǎng)江以北的12個(gè)地區(qū)。其中，大家鼠Rattus norvegicus（X14848）在發(fā)育樹(shù)中處于最外1個(gè)分支，與發(fā)育樹(shù)內(nèi)其他2個(gè)分支關(guān)系較遠(yuǎn)；發(fā)育樹(shù)中第2個(gè)分支包括M.m.castanues（EF108342）和長(zhǎng)江以南6個(gè)地區(qū)的8個(gè)個(gè)體（TW1、WH、PX、KM、TW2、TW3、GX、GZ），說(shuō)明這8個(gè)個(gè)體屬于M.m.castanues亞種；長(zhǎng)江以北12個(gè)地區(qū)的12個(gè)個(gè)體（HZ、YA、DT、CZ、UQ、HF、KZ、CY、SL、LY、BT和MH）與M.m.musculus（EF108345）構(gòu)成第3個(gè)分支，說(shuō)明這12個(gè)個(gè)體屬于M.m.musculus亞種。UQ與HF、MH與CY、SL與DT以及WH與PX、TW2與TW3、GX與GZ兩兩分別具有相同的支長(zhǎng)，說(shuō)明其DNA序列相同，表明它們來(lái)自同一母系祖先。這些結(jié)果顯示，中國(guó)小家鼠基因來(lái)源較復(fù)雜，以長(zhǎng)江為界，可分為南北2大亞種：南方為M.m.castanues亞種，北方為M.m.musculus亞種。但由于所用分子標(biāo)記有限，要想得到更詳盡的數(shù)據(jù)，應(yīng)進(jìn)一步擴(kuò)大采樣范圍與樣品數(shù)量，并使用更多的分析標(biāo)記來(lái)進(jìn)行分析。

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