CS/HACC/GP溫敏水凝膠復(fù)合 MSCs的實驗研究*

李廣峰吳獻民楊國慶張友忠曹中華尹志峰何國云王靜成楊建東*

論著·實驗研究

CS/HACC/GP溫敏水凝膠復(fù)合 MSCs的實驗研究*

李廣峰1吳獻民1楊國慶1張友忠1曹中華1尹志峰1何國云1王靜成2楊建東2*

目的 制備殼聚糖 (CS)/殼聚糖季銨鹽 (HACC)/甘油磷酸鈉 (GP)溫敏性水凝膠，檢測其成膠時間、超微結(jié)構(gòu)、滲透壓、生物安全性等性質(zhì)，將其和骨髓間充質(zhì)干細胞(MSCs)復(fù)合培養(yǎng)，觀察MSCs的生長情況。方法 制備殼聚糖季銨鹽，將殼聚糖/殼聚糖季銨鹽/甘油磷酸鈉按一定配比制備溫敏性水凝膠，觀察其成膠情況、內(nèi)部超微結(jié)構(gòu)，測量孔隙率、孔徑大小，評估其降解情況，進行生物安全性檢測。將 MSCs與支架復(fù)合培養(yǎng)，倒置顯微鏡觀察凝膠表面細胞生長情況，掃描電鏡觀察凝膠內(nèi)部細胞的生長、增殖情況。結(jié)果 成功制備 HACC，水凝膠37℃時10分鐘可成膠，生物安全性好，滲透壓為290～310 mmol/kg，水凝膠無細胞毒性，其浸提液對小鼠體重增加無影響。掃描電鏡見內(nèi)部結(jié)構(gòu)多空疏松的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，孔徑50～100um，孔隙率≥85%，降解時間約12周。MSCs在水凝膠中能正常生長、增殖。結(jié)論 本實驗證明CS/HACC/GP溫敏水凝膠孔隙率、孔徑大小合適，無細胞毒性，適合MSCs生長、增殖，具有較大的潛力成為神經(jīng)組織工程中的細胞支架。

殼聚糖季銨鹽；溫敏水凝膠；生物安全性；骨髓間充質(zhì)干細胞

前言

脊髓神經(jīng)損傷后，腦脊膜的開放易造成細胞彌散流失，不利于細胞粘附于受損部位的組織進行分化和增殖，斷端神經(jīng)膠質(zhì)及結(jié)締組織增生形成的斑痕組織阻礙了再生神經(jīng)纖維向前生長，加之營養(yǎng)缺乏、代謝障礙等原因，細胞和組織容易雜亂生長使其達不到原位而失去功能。近年來脊髓組織工程技術(shù)的興起為脊髓損傷后神經(jīng)功能的修復(fù)帶來了新的希望，該技術(shù)將具有生物活性的細胞、支架等復(fù)合物植入于脊髓損傷部位后可構(gòu)成細胞遷移和軸突生長的模板，提供神經(jīng)再生的微環(huán)境，誘導(dǎo)軸突粘附、分枝向靶目標生長，隨著再生的軸突遷移并包裹神經(jīng)纖維，橋接修復(fù)損傷的組織，減少中樞神經(jīng)膠質(zhì)瘢痕形成，引導(dǎo)細胞的正常的生長、增殖、分化、遷移、表型以及凋亡，引導(dǎo)軸突再生到灰質(zhì)和白質(zhì)內(nèi)，促進脊髓神經(jīng)的再生[1-3]，恢復(fù)其解剖學(xué)的結(jié)構(gòu)和功能[4]。溫度敏感水凝膠屬于復(fù)合支架材料，被廣泛應(yīng)用于組織工程、藥物釋放系統(tǒng)等的研究。骨髓間充質(zhì)干細胞[5-7]作為脊髓組織工程的種子細胞之一，易于分離和培養(yǎng)擴增，在體內(nèi)、體外均有分化為神經(jīng)細胞和膠質(zhì)細胞的潛能，可從骨髓穿刺獲取，操作容易，損傷少，安全性好，可實現(xiàn)自體移植，具有免疫原性弱，有廣闊的應(yīng)用前景[8,9]。

1 實驗材料和儀器

殼聚糖，氫氧化鈉，異丙醇，冰醋酸， ,-甘油磷酸鈉 (,-GP)，氯化縮水甘油三甲基銨 (環(huán)氧值 84.57%)，DMEM，胎牛血清，骨髓間充質(zhì)干細胞 (MSCs,本實驗室自備)，MilliQ plus超純水系統(tǒng)，Tensor27傅立葉變換紅外光譜儀，AVANCE600核磁共振波譜儀，S648-恒溫水浴箱，電子天平，Labconco系列冷凍干燥機，循環(huán)水式真空抽濾泵，超凈工作臺，WFJ72系列可見分光光度計，Zetasizer HS3000檢測儀，磁力攪拌器，pH-3BC精密數(shù)顯酸度計，XL-30ESEM環(huán)境掃描電子顯微鏡，倒置熒光顯微鏡，CO2細胞培養(yǎng)箱，細胞培養(yǎng)板等。

2 實驗方法

2.1 殼聚糖季銨鹽的制備及物理性能檢測

復(fù)凝聚法制備季銨鹽殼聚糖(HACC)，取少量樣品送揚州大學(xué)檢測中心進行傅立葉變換紅外光及1H-NMR測試。配制HACC過飽和溶液，測量其溶解度。

圖1 殼聚糖與氯化縮水甘油三甲基銨反應(yīng)生成殼聚糖季銨鹽示意圖

2.2 殼聚糖/殼聚糖季銨鹽/甘油磷酸鈉(CS/HACC/GP)溫敏水凝膠的制備

配制50%的 ,-GP溶液、0.1mmol/L的乙酸，0.22um濾器過濾除菌。將0.16gCS與0.02gHACC的混合物及0.18g CS分別溶解于7ml的0.1M乙酸中，攪拌，各加入2ml的H2O(2%W/V)，高壓蒸汽滅菌備用。冰浴攪拌中分別將 , -GP逐滴加入殼聚糖、季銨鹽殼聚糖醋酸溶液 (體積比為1∶4)。繼續(xù)攪拌20分鐘得CS/HACC/GP及CS/GP溫敏水凝膠。將共混液于37℃水浴30分鐘，成膠，液氮中快速冷凍、干燥48小時，掃描電鏡檢測凝膠表面結(jié)構(gòu)。試管倒置法觀察水凝膠37℃的溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變。以試管倒置30秒樣品不流動為凝膠狀態(tài)。

2.3 水凝膠物理性質(zhì)測定

將液態(tài)水凝膠種于96孔板中37℃孵箱培養(yǎng)過夜，滲透壓計測量滲透壓。t時刻水凝膠平衡溶脹率ESR=(Ws-Wd)/ Wd。Wt、Ws、Wd分別是水凝膠在時間t時刻、達到最大溶脹后和干燥狀況下的質(zhì)量。乙醇替代法測量孔隙率，孔隙率=(V0-V2)/(V1-V2)×100%。測5次取平均值。將材料剪成規(guī)則的條狀 (W0)，浸在10mL的37.0℃PBS(pH=7.4)中，每周換液，定期取樣，沖洗后干燥稱重，第n次重量為Wn。重量損失L=(W0-Wn)/W0×100%。每周測降解液pH值。每4周進行電鏡掃描檢測。

2.4 水凝膠生物安全性檢測

參照浸提液細胞毒性實驗標準，制備水凝膠37℃細胞培養(yǎng)液24小時浸提液，稀釋成原液濃度的75%、50%、25%、12.5%、6.25%。配制MMT液，選擇生長良好的4代MSCs，用培養(yǎng)液 (不含血清)配成單細胞懸液，每孔2.5×104個細胞接種到96孔板，每孔體積200ul。37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時，每孔加不同稀釋比例的材料浸提液，繼續(xù)孵育24小時。每孔加MTT20ul，孵育4小時，終止培養(yǎng)，吸棄上清，每孔加150ulDMSO，振蕩10分鐘，使結(jié)晶物充分融解。選擇490nm波長，在酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀上測定各孔光吸收值 (A值)，細胞相對增殖率 (RGR)=(實驗組A均值/陰性對照組值)×100%，根據(jù)計算值進行細胞毒性分級 (0-5級)。

表1 細胞相對增殖率及細胞毒性的分級關(guān)系

急性全身毒性實驗：取15只小鼠，17～23g，雌雄不限，隨機分三組，每組5只。按25ml/Kg將24小時水凝膠生理鹽水浸提液通過尾靜脈注射，陰性對照為同批號無菌生理鹽水，陽性對照為0.25%的除菌苯酚溶液，觀察注射后及24、48、72小時小鼠的一般狀態(tài)、毒性表現(xiàn)及死亡情況，并稱量體重，觀察體重變化。

表2 材料毒性程度評價

溶血實驗：新鮮兔血10ml，再加2%草酸鉀0.5ml抗凝，三個EP管中分別加入浸提液、蒸餾水 (陽性對照)、生理鹽水 (陰性對照)10ml。再加兔血0.2ml，混勻，37℃水浴60分鐘，750g離心5分鐘取上清，分光光度計測545nm的A值。測定兔紅細胞溶解度和血紅蛋白游離程度。公式：(試樣A-陰性)/(陽性A-陰性A)×100%；陰性管A＜0.03，陽性管A為 (0.8±0.30)有效，溶血率≤5%，符合要求。

2.5 MSCs在水凝膠表面的形態(tài)觀察

1.7ml無菌的殼聚糖水凝膠加入6孔細胞培養(yǎng)板中，鋪勻，置37℃細胞培養(yǎng)箱中3小時，使之轉(zhuǎn)變成凝膠狀。每孔接種生長良好的第4代骨髓間充質(zhì)干細胞懸液(1×106cells/ ml)0.5ml，倒置顯微鏡下觀察MSCs形態(tài)及生長情況。

2.6 MSCs在溫敏水凝膠中培養(yǎng)

超凈臺中，冰溶中將1體積GP溶液逐滴加入4體積2% CS/HACC醋酸溶液充分攪拌混勻。按所需細胞接種濃度 (1× 106cells/ml)將制備好的水凝膠溶液與消化收集的MSCs快速充分混懸，(每孔0.5ml混懸液)接種于24孔培養(yǎng)板，37℃培養(yǎng)箱內(nèi)靜置10分鐘。各孔滴加lml含血清DMEM繼續(xù)培養(yǎng)，兩天換液一次。倒置顯微鏡觀察細胞在凝膠內(nèi)粘附、生長和增殖等情況。在細胞接種后選擇不同時間取出復(fù)合材料，戊二醛固定后送揚州的大學(xué)檢測中心做掃描電鏡(SEM)觀察。

3 統(tǒng)計學(xué)分析

4 結(jié)果

圖2 殼聚糖(CS)及殼聚糖季銨鹽(HACC)的傅里葉紅外光譜圖(FTIR)

圖3 殼聚糖季銨鹽 (HACC)1HNMR譜圖

4.1 殼聚糖季銨鹽的物理性能檢測

由圖2、3見：紅外光譜圖的HACC波長1599.0cm-1處的吸收峰消失，表明殼聚糖分子中親核中心-NH2上的H已被-CH2CH(OH)CH2N+(CH3)Cl-取代生成了2-羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖(HACC)。在3400.0cm-1處HACC的吸收峰變寬，說明-OH的吸收變強，陽離子醚化劑與殼聚糖的氨基上發(fā)生取代，基本不與苯環(huán)上的羥基反應(yīng)。核磁分析見殼聚糖季銨鹽的1HNMR譜圖在 =3附近出現(xiàn)很明顯的強峰，代表季銨基團-N+(CH3)3最大吸收峰，說明在所選擇的反應(yīng)條件下季銨基殼聚糖衍生物確實已形成。（圖2彩圖見插頁）

4.2 水凝膠成膠過程及物理性能

圖4 殼聚糖/季銨鹽殼聚糖/溫敏水凝膠在37℃下由溶膠態(tài)到凝膠態(tài)凝膠的轉(zhuǎn)變過程，1-6代表時間的先后順序

圖5 CS/HACC/GP水凝膠修剪成形后外觀

圖6 CS/HACC/GP水凝膠經(jīng)冷凍干燥后的外觀

溫敏水凝膠在溫度低于體溫時保持液體流動狀態(tài)，高于體溫時則轉(zhuǎn)變成凝膠狀態(tài)。溫敏性水凝膠在37°C水浴中10分鐘成膠。成膠前為透明、流動性液體，成膠后為固態(tài)、乳白色凝膠成膠前溶液可用注射針頭注射。成膠后則不可注射具有一定粘性，不沾手，具有一定彈性，硬度與脊髓組織相似，可任意塑型。在低糖培養(yǎng)液中的滲透壓為290～310mmol/ kg。溶脹實驗中，水凝膠在PBS中1小時達到平衡，平衡溶脹率為250%。

圖7 水凝膠的掃描電鏡圖。圖A1(×5000)、B1(×2500)、C1(×1000)、D1(×500)為CS/HACC/GP掃描電鏡圖，A2(×5000)、B2(×2000)、C2 (×1000)、D2(×500)為CS/GP掃描電鏡圖

由上圖可見：水凝膠內(nèi)部結(jié)構(gòu)均為相互連接貫通的三維多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，HACC為水溶性鹽類，它的加入可使整個CS/HACC/GP水凝膠體系中分散的較單純CS/GP水凝膠更加均勻，內(nèi)部結(jié)構(gòu)更加規(guī)則，內(nèi)部網(wǎng)絡(luò)連接更多。CS/HACC/ GP水凝膠在冷凍干燥過程中，失水迅速，分枝結(jié)構(gòu)增多，因此孔徑會較CS/GP水凝膠增大。CS/HACC/GP水凝膠表面略顯粗糙，更利于MSCs的細胞粘附，其孔徑大小約50～100um，該支架具有豐富的孔隙率，孔隙率在85%以上，較單純CS/GP水凝膠更為適合MSCs生長、增殖、分化及物質(zhì)交換的需要。本實驗中乙醇替代法測定孔隙率在85%以上，與掃面電鏡觀察到的結(jié)果一致。

圖8 殼聚糖/殼聚糖季銨鹽/甘油磷酸鈉水凝膠掃描電鏡圖，將固體水凝膠浸入PBS(37℃，pH=7.4)中，于設(shè)定的時間取出行掃描電鏡檢測，A、B、C、D分別為材料降解0、4、8、12周后的掃描電鏡圖，放大倍數(shù)分別為：A1(×500)、A2(×100)、B1(×700)、B2(×5000)、C1(×1000)、C2 (×5000)、D1(×5000)、B2(×10000)

由上圖可見材料內(nèi)部具有孔隙率較高的網(wǎng)狀連接的三維立體結(jié)構(gòu)，最初孔徑約50～100um，隨著時間的推移，支架的空隙會逐漸增多，孔徑逐漸增大，在8周以后降解更加明顯，第12周時幾乎完全失去材料的正常形態(tài)，呈碎片狀，這樣就能及時為細胞生長提供足夠的空間，不至于妨礙正常細胞組織的生成。

降解情況：降解率隨著時間的遷移，逐漸增加。前8周支架降解緩慢，在第8以后降解速度增加，第12周時降解率近86%，可及時為種植于其中的細胞生長、組織生成騰出適當空間。降解液pH值在12周內(nèi)基本平穩(wěn)，在7.20左右，體內(nèi)pH值很接近。

圖9 在不同時間測定材料的質(zhì)量損失率代表材料的降解率

圖10 每周將材料從PBS(pH=7.4)中取出，測定材料的降解液pH值

4.3 細胞毒性

圖11 MSCs細胞在浸提液中培養(yǎng)24小時鏡下圖片（×40）

圖12 小鼠尾靜脈注射生理鹽水、浸提液、苯酚溶液后不同時間體重變化

由圖11可見細胞在浸提液中培養(yǎng)24小時后，絕大部分貼壁，細胞伸展生長良好，細胞呈梭形、多邊形或不規(guī)則形，無明顯的細胞結(jié)構(gòu)損傷，細胞在支架浸提液中培養(yǎng)未見明顯毒性反應(yīng)。（圖11、12彩圖見插頁）

圖13 MSCs培養(yǎng)24小時后，不同濃度的材料浸提液吸光度值，1原液，2 75%浸提液，3 50%浸提液，4 25%浸提液，5 12.5%浸提液，6 6.25%浸提液，7對照組(細胞培養(yǎng)液)

MTT細胞毒性結(jié)果示各濃度浸提液與對照組吸光度值相比均無明顯差異(P＞0.05)，組間亦無明顯差異(P＞0.05)。表明材料浸提液對細胞無毒性，MSCs在水凝膠浸提液浸提液中相對增殖率高于80%，細胞增殖力毒性評級為0-1級，說明殼聚糖水凝膠具有良好的細胞相容性，殼聚糖水凝膠可作為細胞培養(yǎng)的支架材料。

急性全身毒性實驗：材料浸提液組、生理鹽水組注射后小鼠全身一般狀態(tài)良好，未見毒性反應(yīng)及死亡，24、48、72小時體重均明顯增加。苯酚組注射后出現(xiàn)寒戰(zhàn)，發(fā)抖，眼睛略有水汪汪表現(xiàn)，十幾分鐘后逐漸好轉(zhuǎn)，一般狀態(tài)尚好，無動物死亡，24、48、72小時體重增加前兩組較少。浸提液組小鼠體重增加與生理鹽水組 (陰性對照組)比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。苯酚組 (陽性對照組)與生理鹽水組 (陰性對照組)比較有統(tǒng)計學(xué)意義 (P＜0.05)。說明浸提液對小鼠無急性全身毒性反應(yīng)。

表3 全身急性毒性實驗動物體重變化情況

溶血實驗：浸提液組、生理鹽水組肉眼觀未見溶血反應(yīng)，液體分層，上層為清涼無色液體，下層為暗紅色紅細胞沉淀物。圖片鏡檢未見紅細胞形態(tài)破裂或凝聚。蒸餾水組外觀為均勻一體的紅色，鏡下見紅細胞絕大部分破碎，凝聚，細胞形態(tài)消失。陰性管A＜0.03，陽性管吸光度為(0.8±0.20)，符合標準。浸提液的溶血率≤5%，體外實驗不引起溶血反應(yīng)，滿足醫(yī)用生物材料的要求。

4.4 MSCs的培養(yǎng)及傳代

圖14 倒置顯微鏡下第4代第7天的骨髓間充質(zhì)干細胞形態(tài)(左，×40)；倒置顯微鏡下第4代第7天的骨髓間充質(zhì)干細胞形態(tài)(右，×100)

圖為倒置顯微鏡鏡下原代培養(yǎng)的第3代培養(yǎng)第6天的骨髓間充質(zhì)干細胞生長狀態(tài)，鏡下細胞的形態(tài)呈長梭形，見其生長良好。(彩圖見插頁）

材料表面細胞形態(tài)觀察：

圖15 分別為在材料表面培養(yǎng)的MSCs第1、3、5、7天倒置顯微鏡下圖像

細胞能在支架材料上良好附著、生長和增殖，伸展良好，呈梭形、多邊形或不規(guī)則形，見細胞圓縮及懸浮細胞。細胞接種2小時見其在支架材料表面均勻分布，部分細胞貼附在膜表面上，形態(tài)與成纖維樣細胞形態(tài)類似，為梭形。6～8小時細胞大部分粘附，形態(tài)開始變?yōu)樗笮危?天后首次換液，大部分細胞完成伸展變形，形態(tài)為梭形，呈網(wǎng)狀排列，極少部分細胞仍呈圓形。以后2～3天換液1次。隨培養(yǎng)時間的延長，支架表面上的細胞數(shù)量逐漸增加，但慢于培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)的細胞增殖速度，增殖細胞聚集呈魚群狀生長。（彩圖見插頁）

髓間充質(zhì)干細胞在殼聚糖凝膠中體外培養(yǎng)觀察：

圖16 水凝膠中培養(yǎng)5天的MSCs細胞掃描電鏡圖(A，×2000)；水凝膠中培養(yǎng)5天的MSCs細胞掃描電鏡圖(B，×5000)；圖19-C水凝膠中培養(yǎng)15天的MSCs細胞掃描電鏡圖(C，×1000)；水凝膠中培養(yǎng)15天的MSCs細胞掃描電鏡圖(D，×10000)

支架內(nèi)部結(jié)構(gòu)為三維疏松網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，空隙大于細胞直徑，滿足細胞正常生長、增殖及物質(zhì)交換的需要。骨髓間充質(zhì)干細胞與支架材料復(fù)合培養(yǎng)5天時，細胞牢固茹附于支架材料內(nèi)表面，呈鋪展式生長。15天時，多數(shù)骨髓間充質(zhì)干細胞在支架上呈多角形生長，并生出多條小突起，支架材料及材料多通道內(nèi)表面基本被細胞覆蓋。表明細胞在支架中可以正常吸附貼壁、生長、增殖，細胞與支架具有良好的生物相容性，為CS/ HACC/GP支架聯(lián)合MSCs移植治療脊髓損傷提供了依據(jù)。

5 討論

應(yīng)用于脊髓工程中的溫敏水凝膠制備條件溫和，在室溫或低于室溫下可較長時間保持液態(tài)，而溫度升高到體溫后發(fā)生膠凝，相變溫度與人體體溫接近甚至低于人的體溫，沒有引入化學(xué)交聯(lián)劑等可能產(chǎn)生細胞毒性的物質(zhì)，具有良好的生物相容性和生物可降解性，在組織工程和藥物緩釋載體等方面具有極大的應(yīng)潛力。

在甘油磷酸鹽溫度敏感水凝膠的研究中，Chenite[10]等以甘油磷酸鹽調(diào)控殼聚糖及水分子間相互作用，制備殼聚糖/甘油磷酸鹽水溶性復(fù)合物，以注射方式植入體內(nèi)，原位凝膠化，展示了良好的生物相容性[11]。Zhou和 Wu等[12,13]分別研究了兩種甘油磷酸鹽 (-GP和 ,-GP混合物)對于成膠性能的影響，表明 ,-較 -具有更快的成膠速度。因為 ,-中的 -為線性分子結(jié)構(gòu)，其形成的空間位阻較 -的要小，體系中的CS分子間的疏水相互作用更易于形成。在其它條件保持不變時，甘油磷酸鈉濃度越高，CS/HACC/GP共混液的成膠時間越短。另外， ,-GP呈弱堿性，能與酸中和，起到緩沖電解質(zhì)的作用。但甘油磷酸鈉濃度越高，相應(yīng)的副作用會增加。本實驗選用56%的 ,-GP溶液，成膠時間較合適。

殼聚糖結(jié)構(gòu)類似于動物體內(nèi)的糖胺聚糖，具有抗菌性、生物可降解性、安全無毒、生物相容性、細胞黏附性等獨特優(yōu)良性能[14]。在人體內(nèi)殼聚糖可被溶菌酶等降解，可通過選擇不同的殼聚糖或通過化學(xué)修飾，按照組織工程的不同要求來控制其在體內(nèi)的降解速度。殼聚糖分子表面帶有親水的功能基團，為細胞提供了一定密度的正電荷，通過靜電作用對細胞膜上帶有負電荷的細胞更有親和力，使其便于細胞黏附。Cheng等[15]的實驗提示粘連蛋白-殼聚糖神經(jīng)導(dǎo)管有阻止神經(jīng)膠質(zhì)瘢痕的形成，促進神經(jīng)再生的作用。Lin等[10]研究了用不同比率型膠原/透明質(zhì)酸/殼聚糖制造的復(fù)合多孔支架的特性，證明在該共聚物支架中培養(yǎng)的成纖維細胞的分化很好，型膠原、透明質(zhì)酸、殼聚糖按9∶1∶1的比率制作的復(fù)合支架各種理化性質(zhì)相對最優(yōu)。

殼聚糖季銨鹽水溶性較殼聚糖大為增加。據(jù)文獻[16]介紹，制備水凝膠時，在殼聚糖鏈上引入強親水性的季銨基團，增強了與磷酸基團之間的靜電引力，使得成膠速度明顯縮短。殼聚糖與聚陰離子形成交聯(lián)復(fù)合物溶脹出現(xiàn)皺褶，這種粗糙的表面更利于細胞貼壁。在一定條件下，隨聚陰離子濃度的增加，出現(xiàn)的皺褶更多，引起貼壁率的增加。研究發(fā)現(xiàn)，HACC溶液與GP溶液共混后的體系(HACC/GP)亦有溫敏特性，與CS/GP水凝膠相比，HACC/GP水凝膠呈透明態(tài)，對環(huán)境pH值更敏感。本實驗用廉價的2，3-環(huán)氧丙基三甲基氯化銨為季銨化試劑，成功制備了水溶性更好的殼聚糖季銨鹽衍生物，通過紅外、核磁譜圖分析所合成產(chǎn)物結(jié)構(gòu)，確定生成了殼聚糖季銨鹽。實驗中經(jīng)過對殼聚糖/殼聚糖季銨鹽不同配比成膠效果的對比，發(fā)現(xiàn)殼聚糖與殼聚糖季銨鹽比例為8∶1比較合適，成膠時間較短，約10分鐘，繼續(xù)增加HACC的含量，CS/HACC/GP體系無法成膠。

利于成膠的因素包括低的酸濃度和高的殼聚糖濃度，為了既能保證殼聚糖及其衍生物的溶解，又能保證低的酸濃度，本研究選用酸濃度0.1mol/L，殼聚糖濃度為2%，制備出的水凝支架硬度與脊髓組織相似，不黏手，孔隙率在85%以上，具有生物降解性，降解液基本呈中性，因此該水凝膠可為神經(jīng)干細胞的生長及營養(yǎng)物質(zhì)交換提供足夠的空間。如果將水凝膠在普通條件下干燥，水凝膠干燥后的體積變化會很大，這樣就使水凝膠的孔洞結(jié)構(gòu)因水分的失去而塌陷，本研究采用液氮淬冷后冷凍干燥的方法，可以使水凝膠的孔洞結(jié)構(gòu)得到較好的保持。

本實驗根據(jù)ISO10993.1和GB/T16886.1系列標準[17]中規(guī)定，進行支架材料的生物安全性評價，發(fā)現(xiàn)材料浸提液有良好的血液相容性，體外實驗無明顯溶血反應(yīng)，滿足醫(yī)用材料要求。該研究采用原代培養(yǎng)的MSCs作為種子細胞，并將MSCs與凝膠復(fù)合培養(yǎng)，并通過冷凍復(fù)合物后由電鏡觀察到細胞生長狀態(tài)良好，進一步說明了MSCs可在水凝膠中正常生長。

該研究為CS/HACC/GP溫敏水凝膠聯(lián)合MSCs治療脊髓損傷提供一定的理論基礎(chǔ)，但目前研究制備的殼聚糖溫敏水凝膠性能方面，還有待進一步發(fā)展，如低溫條件下凝膠-溶膠轉(zhuǎn)變速度慢甚至不具有可逆性等。制備具有良好的生物力學(xué)性能、可逆性及快速響應(yīng)性的殼聚糖基溫敏水凝膠以滿足不同需求，最終應(yīng)用到臨床治療中，是今后研究的主要方向?？傊?，該殼聚糖季銨鹽/殼聚糖/甘油磷酸鈉凝膠有良好的生物安全性，可作為脊髓組織工程的載體材料中細胞的良好載體，為脊髓損傷的修復(fù)帶來了新的希望。

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Experimental research on CS/HACC/GP temperature-sensitive hydrogel loaded with MSCs

Li Guangfeng1,Wu Xianmin1,Yang Guoqing1,et al.1Department of Orthopaedics,China Metallurgical Hospital, Shanghai,225001;2 Department of Orthopaedics,Clinical College of Yangzhou Clinical,Yangzhou Jiangsu,225001,China

Objective To fabricate a temperature-sensitive hydrogel and identify its characteristics such as porosity,degradation rate,microscopic structure and biocompatibility of the cell scaffold.To observe growth and proliferation of BMSCs in the scaffold.Methods In this experimental,we modified Cs to obtain a new derivative of Cs,HACC.The hydrogel was fabricated by proper riato of CS/HACC/GP mixed solution prompted by temperature.The gelation time was decided.The cross-section morphology andporosity of the scaffolds was examined.The weight loss was calculated and the change of its aspect and shape was measured at set time.The biological safety of the hydrogel was evaluated.Then MSCs were seeded into the hydrogel.Cell adhesion and morphology of MSCs were analysed by SEM.Results HACC andCS/HACC/GP Temperature-sensitive Hydrogel wassuccessfully synthesized.The osmolality of the hydrogel was range of 290-310 mmol/kg.Gelation time of CS/HACC/GP hydrogel was around 10 minutes.Macroporous internal morphology with pore size ranging from50 to 100um was observed in CS/HACC/GP scaffold.It had a high macro porosity of greater than 85 percent.The time of CS/HACC/GP scaffold degradation completely was 12 weeks in vitro.From the SEM observation,the proliferation and metabolism of MSCs cultured on the three-dimensional hydrogel cell culture grew well.Conclusion The hydrogel with high porosity and a moderate degradation rate,without cytotoxicity,was suited for MSCs to grow and multiply.The hydrogel have the huge potential to be used as an optional carrier of transplanted cells for nerve tissue engineering.

HACC;Temperature-sensitive hydrogel;Biological safety;MSCs

R318.08

A

10.3969/j.issn.1672-5972.2014.04.002

swgk2014-01-0013

李廣峰(1983-)男，醫(yī)學(xué)碩士，醫(yī)師。研究方向:脊柱外科。

*[通訊作者]楊建東(1969-)男，醫(yī)學(xué)博士，主任醫(yī)師，副教授。研究方向:脊柱外科。

2014-01-26)

國家自然科學(xué)基金資助項目(81071466)

1上海中冶醫(yī)院骨科，上海200941；2江蘇省蘇北人民醫(yī)院骨科，江蘇揚州225001