基于石墨烯-海藻酸鈉復(fù)合材料的辣根過氧化物酶?jìng)鞲衅餮芯?/h1>
2014-04-28 02:40:43肖福兵楊欣田銳張瑞蓮梅瓊之吳朝陽
化學(xué)傳感器 2014年1期
肖福兵，楊欣，2，田銳，張瑞蓮，梅瓊之，吳朝陽*
(1.湖南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，化學(xué)生物傳感與計(jì)量學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南長沙 410082)（2.懷化學(xué)院化學(xué)與化學(xué)工程系，湖南懷化 418008）
基于石墨烯-海藻酸鈉復(fù)合材料的辣根過氧化物酶?jìng)鞲衅餮芯?/p>
肖福兵1，楊欣1，2，田銳1，張瑞蓮1，梅瓊之1，吳朝陽1*
(1.湖南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，化學(xué)生物傳感與計(jì)量學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南長沙 410082)（2.懷化學(xué)院化學(xué)與化學(xué)工程系，湖南懷化 418008）
構(gòu)建了一種以海藻酸鈉－石墨烯（SA－GR）為基底的新型過氧化氫電化學(xué)酶?jìng)鞲衅?。利用滴涂法將生物相容性良好的海藻酸鈉－石墨烯復(fù)合物固定在玻碳電極表面，再通過酰胺鍵將HRP連接在SA－GR復(fù)合膜上，從而制備出了性能良好的過氧化氫電化學(xué)酶?jìng)鞲衅?。該傳感器重現(xiàn)性好、靈敏度較高，并且響應(yīng)速度快（3 s），米氏常數(shù)較低（Km=0．663），對(duì)H2O2檢測(cè)的線性范圍為1．0×10－4～1．2×10－3mol/L，檢測(cè)下限為5．7×10－6mol/L。
海藻酸鈉；石墨烯；辣根過氧化物酶
0 引言
石墨烯作為一種新型的二維納米材料，其晶體薄膜只有一個(gè)碳原子的厚度，是目前室溫下導(dǎo)電速度最快、導(dǎo)熱能力最強(qiáng)、力學(xué)強(qiáng)度最大的材料之一。因其獨(dú)特的性質(zhì)，石墨烯引起了極大的關(guān)注，在工業(yè)中有了廣泛的應(yīng)用，如儲(chǔ)能［1］，催化劑載體［2］，熱傳輸介質(zhì)［3］和電子元件［4］等。同時(shí)，石墨烯具有良好的生物相容性，所以其在電化學(xué)生物傳感器中也廣泛被應(yīng)用［5～7］。
海藻酸鈉，又叫褐藻酸鈉，是從褐海藻中提取出的天然多糖，具有良好的親水性，生物相容性，并且無毒性。在Ca2+存在下能形成不溶于水的海藻酸鈣凝膠，海藻酸鈣常用作生物催化劑的負(fù)載基底。同時(shí)，海藻酸鈉又是一種很好的成膜材料，能與其它材料在電極表面形成復(fù)合膜，其表面可以固定蛋白質(zhì)或其它生物分子［8～9］。
過氧化氫，在生物體內(nèi)，是許多酶催化反應(yīng)的代謝產(chǎn)物，是體內(nèi)氧化應(yīng)激重要的標(biāo)志物［10］；在工業(yè)生產(chǎn)中，是工業(yè)和食品等領(lǐng)域的副產(chǎn)物。此外，在臨床、藥物和環(huán)境分析等領(lǐng)域過氧化氫含量的測(cè)定也非常重要［11～12］。隨著分析方法的不斷發(fā)展，測(cè)定過氧化氫的方法也越來越多，如滴定分析法［13］、熒光法［14］、高效液相色譜法［15］、比色法［16］、分光光度法［17］、化學(xué)發(fā)光法［18］和電化學(xué)法［19］等。其中，電化學(xué)方法由于具有操作簡(jiǎn)單，選擇性和靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于過氧化氫的分析。
該文利用海藻酸鈉、石墨烯復(fù)合材料在電極表面共同成膜，再通過Ca2+對(duì)膜進(jìn)行交聯(lián)固化后，用EDC/NHS活化復(fù)合膜表面的羧基，最后通過酰胺鍵將辣根過氧化物酶固定在電極表面，從而構(gòu)建出一種以海藻酸鈉和石墨烯為基底的新型過氧化物酶電化學(xué)傳感器，并研究了該傳感器對(duì)過氧化氫的分析測(cè)定和其電化學(xué)行為。
1 實(shí)驗(yàn)部分
1.1 試劑和儀器
海藻酸鈉（SA，Sigma－Aldrich）；石墨烯（GR，南京先豐納米材料有限公司）；辣根過氧化物酶（HRP，上海鼎國生物技術(shù)有限公司）；1－（3－二甲氨基丙基）－3－乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC，Sigma－Aldrich）；N－羥基丁二酰亞胺（NHS，上海源葉生物科技有限公司）；0．3μm和0．05μm鋁粉（上海辰華儀器有限公司）;二水磷酸氫二鈉、十二水磷酸二氫鈉、鐵氰化鉀、亞鐵氰化鉀、氯化鉀、氯化鈣均購于（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分析純）。其它試劑均為分析純，所用到的水溶液均用超純水（R=18．25MΩ）配制。
CHI900B電化學(xué)工作站（上海辰華儀器有限公司）；三電極系統(tǒng)：修飾辣根過氧化物酶－海藻酸鈉－石墨烯的玻碳電極（HRP－SA－GR/GC）作為工作電極，飽和Hg2Cl2電極（SCE）作為參比電極，鉑電極（Pt）作為對(duì)電極。
1.2 海藻酸鈉-石墨烯修飾電極的制備及HRP的固定
取4mg石墨烯和4mg海藻酸鈉于3mL的血清瓶中，加入2mL滅菌水，對(duì)其超聲分散2 h，得到均勻分散的黑色懸濁液（SA－GR）。將此懸濁液置于冰箱4℃保存?zhèn)溆谩?/p>
玻碳電極的預(yù)處理：玻碳電極在使用前，首先分別用0．3μm和0．05μm的氧化鋁粉末打磨處理，至電極表面成光滑的鏡面，再將電極分別用超純水、乙醇、超純水各超聲5min洗凈，最后用N2吹干。
在已預(yù)處理的玻碳電極表面滴加8μL已制備的SA－GR黑色懸濁液，在室溫條件下讓其自然干燥；待完全風(fēng)干后，在其上滴加5μL 4% CaCl2溶液，反應(yīng)1 h，讓海藻酸鈉與Ca2+反應(yīng)生成不溶于水的海藻酸鈣，超純水清洗電極表面未反應(yīng)的Ca2+，氮?dú)獯蹈?；?μL EDC（126mmol/L）/ NHS（63mmol/L）溶液滴在修飾電極表面，活化羧基1 h；最后，8μL 20mg/mLHRP滴在上面已修飾好的電極表面，放于濕度為100%、溫度為4℃的密閉容器中反應(yīng)過夜。這樣即制得了辣根過氧化物酶?jìng)鞲衅鳎℉RP－SA－GR/GC）。構(gòu)建過程如圖1所示。
2 結(jié)果與討論
2.1 電極修飾過程的電化學(xué)表征
采用循環(huán)伏安法對(duì)電極的修飾過程進(jìn)行了表征。圖2是不同電極在電位區(qū)間為0．3～－0．8 V、緩沖液為0．1 mol/L PBS（pH=7．0）中的循環(huán)伏安曲線。由圖2可知，裸玻碳電極（GC）（曲線c）和SA－GR修飾的玻碳電極（曲線b）均未出現(xiàn)明顯的氧化還原峰，但是SA－GR修飾的玻碳電極背景電流有顯著增加，這說明GR－SA顯著地增大了電極的導(dǎo)電能力和有效表面積。HRPSA－GR電極（曲線a）在－0．4 V和－0．1 V附近出現(xiàn)了一對(duì)氧化還原峰，通過與曲線a、b進(jìn)行對(duì)比可知這是HRP的氧化還原峰。綜合比較圖2曲線a、b、c可得知，HRP成功的被修飾在SA－GR基底表面并且能夠較好的進(jìn)行直接電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)。
2.2 掃描速度對(duì)峰電流的影響
考察了掃描速度對(duì)HRP－SA－GR/GC峰電流的影響，分別選取掃速為100、200、300、400、500 mV/s。如圖3，HRP－SA－GR/GC的氧化還原峰電流隨著掃描速率的增加而增大。由圖4可知氧化、還原峰電流與掃描速率（100～500mV/s）呈良好的線性關(guān)系，說明在該掃描速率范圍內(nèi)，電極反應(yīng)受表面過程控制。
圖1 辣根過氧化物酶?jìng)鞲衅鳂?gòu)建示意圖Fig．1 The schematic of the HRPbiosensor fabrication process
圖2 不同修飾電極的循環(huán)伏安圖a）HRP－SA－GR/GC，b）SA－GR/GC和c）GCFig．2 The CVsof differentmodified electrodes a）HRP－SA－GR/GC，b）SA－GR/GC and c）GC
圖3 不同掃速下的循環(huán)伏安圖a～e：500、400、300、200和100mV/sFig．3 The CVsof themodified electrodeatdifferentscan rates．a(chǎn)～e：500、400、300、200 and 100mV/s
2.3 pH值對(duì)催化活性的影響
由于酶的活性受pH值的影響很大，實(shí)驗(yàn)研究了緩沖液的pH值對(duì)酶?jìng)鞲衅鞯挠绊?。圖5（A～E）是酶電極在pH6．0～pH8．0的PBS中加入1 mmol/LH2O2的計(jì)時(shí)電流曲線。由圖5（F）可知，在pH6．0～pH8．0的范圍內(nèi)，隨著pH的增大i-t曲線響應(yīng)電流的變化先增大后減小，在pH=7．0時(shí)響應(yīng)電流為最大值，同時(shí)比較圖5（A～E）可以看出，當(dāng)pH=6．0時(shí)酶電極的響應(yīng)時(shí)間變長，響應(yīng)時(shí)間由最快的3 s延長到20 s以上，這可能是由于pH過低導(dǎo)致酶電極活性受到抑制，因此選擇pH= 7．0的PBS作為檢測(cè)緩沖溶液。
2.4 干擾實(shí)驗(yàn)
為了考察酶電極的特異性，加入了一些常見的干擾物質(zhì)來研究傳感器的抗干擾能力。如圖6所示，向pH=7．0的PBS溶液中依次加入1 mmol/LH2O2、10mmol/L葡萄糖（GLC）、10mmol/L抗壞血酸（AA）；以酶電極為工作電極，在－0．4 V下進(jìn)行計(jì)時(shí)電流掃描。從圖中可以很明顯的看出，相對(duì)于H2O2的電流響應(yīng)抗壞血酸和葡萄糖的電流響應(yīng)很小，基本可以忽略。說明此傳感器對(duì)H2O2有著良好的選擇性，具有很好的抗干擾能力。
圖4 峰電流與掃描速度的關(guān)系Fig．4 The relationship between peak currentand the sweep rate
圖5 不同pH值下催化H2O2的計(jì)時(shí)電流曲線Fig．5 Amperometric responsesofH2O2catalysed atdifferentpH values
2.5 對(duì)過氧化氫的計(jì)時(shí)電流響應(yīng)
為了研究HRP－SA－GR/GC中HRP對(duì)過氧化氫的電催化能力，分別對(duì)SA－GR/GC和HRPSA－GR/GC在PBS緩沖溶液（pH=7．0，0．1mol/L）中進(jìn)行計(jì)時(shí)電流掃描，如圖7所示，曲線a為HRP－SA－GR/GC在加入1mmol/LH2O2的緩沖溶液中的計(jì)時(shí)電流曲線，曲線b為SA－GR/GC在加入1mmol/LH2O2的緩沖溶液中的計(jì)時(shí)電流曲線?？梢缘弥猄A－GR/GC的電流響應(yīng)較小，而HRP－SA－GR/GC電極對(duì)過氧化氫的響應(yīng)明顯，曲線a的響應(yīng)電流約為曲線b的7倍。對(duì)比可知，曲線a相對(duì)于曲線b增大的電流即是HRP對(duì)H2O2的催化還原電流。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，固定在SA－GR上的HRP保持其良好的生物催化活性，能有效催化H2O2的電化學(xué)還原。
同時(shí)，通過采用計(jì)時(shí)電流實(shí)驗(yàn)研究了酶電極的電流響應(yīng)與H2O2濃度之間的關(guān)系。實(shí)驗(yàn)的電位設(shè)定在－0．4 V，緩沖液為pH=7．0的PBS（通入N2除氧），實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖8，圖9所示，HRP－SAGR/GC對(duì)H2O2的響應(yīng)隨著其濃度的增加，響應(yīng)電流逐漸變大，當(dāng)加入的H2O2濃度越大，電流變化越明顯；并且響應(yīng)電流與過氧化氫的濃度在1．0×10－4～1．2×10－3mol/L范圍內(nèi)呈現(xiàn)出了良好的線性關(guān)系。線性方程為：I（μA）=2．83+0．003 8 c（μmol/L）（r=0．998）。基于3倍信噪比，可求得該傳感器的檢測(cè)下限為5．7×10－6mol/L（S/N=3）。
圖6 干擾實(shí)驗(yàn)Fig．6 Interference experiment
圖7 不同修飾電極對(duì)1mmol/LH2O2的響應(yīng)a）HRP－SA－GR/GC和b）SA－GR/GCFig．7 The responseofdifferentelectrodes for1mmol/L H2O2．a(chǎn)）HRP－SA－GR/GCand b）SA－GR/GC
圖8 連續(xù)加入100μmol/LH2O2的計(jì)時(shí)電流響應(yīng)曲線Fig．8 The response forsuccessiveaddition of100μmol/L H2O2
圖9 H2O2濃度與電流的線性關(guān)系Fig．9 The linear relationship between the concentration of H2O2and the current
2.6 HRP-SA-GR/GC表觀米氏常數(shù)的測(cè)定
如圖9，酶電極HRP－SA－GR/GC測(cè)定H2O2時(shí)，當(dāng)過氧化氫的濃度較小時(shí)，它的穩(wěn)態(tài)響應(yīng)電流I隨c線性增大；當(dāng)c較大時(shí)，I與c基本無關(guān)，表現(xiàn)出Michaelis－Menten的動(dòng)力學(xué)特征。根據(jù)Michaelis－Menten方程Iss－1=1/Imax+Km/（Imaxc），其中的Iss為加入一定濃度底物后的響應(yīng)電流，Imax為所加底物飽和時(shí)的極限（最大）電流，c為加入的底物濃度，米氏常數(shù)是表征酶與底物之間親和力的統(tǒng)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)［20］。通過對(duì)H2O2的濃度的倒數(shù)（c－1）和其對(duì)應(yīng)的電流響應(yīng)的倒數(shù)（Iss－1）作圖（圖10）可求算出該生物傳感器的米氏常數(shù)為0．663mmol/L，這比文獻(xiàn)中報(bào)道的值要?。?1～24］。較小的米氏常數(shù)表明通過該方法固定的酶能保持其良好催化活性，同時(shí)也說明它與H2O2的親和力較大。
圖10 米氏常數(shù)的測(cè)定Fig．10 The determ ination ofm ichaelis constant
3 結(jié)論
通過滴涂法把生物相容性良好的復(fù)合膜SA－GR固定到電極表面，然后再通過酰胺鍵將HRP固定在SA－GR復(fù)合膜上，從而制備出了性能良好的過氧化氫電化學(xué)酶?jìng)鞲衅?。HRP在PBS緩沖液中能發(fā)生直接電子轉(zhuǎn)移。該傳感器靈敏度較高，重現(xiàn)性好，具有較低的米氏常數(shù)（Km=0．663），對(duì)H2O2的檢測(cè)線性范圍為1．0×10－4～1．2×10－3mol/L，檢測(cè)下限為5．7×10－6mol/L（S/N= 3），響應(yīng)時(shí)間低至3 s。SA－GR復(fù)合材料為生物催化和生物電化學(xué)傳感器的研究提供了一個(gè)良好的檢測(cè)平臺(tái)。
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Graphene-sodium alginate com positebased horseradish peroxidase biosensor
Xiao Fu-bing1，Yang Xin1，2，Tian Rui1，Zhang Rui-lian1，MeiQiong-zhi1，Wu Zhao-yang1*
（1．State Key Laboratory ofChemo/Biosensingand Chemometrics，CollegeofChemistry and ChemicalEngineering，Hunan University，Changsha410082，China）（2．DepartmentofChemistry and Chemical Engineering，Huaihua Collge，Huaihua418008，China）
A new type of enzyme electrochemicalsensor for hydrogen peroxidewas constructed alginate－graphene（SA－GR）composite．The biocompatible alginate－graphene composite is fixed to the glassy carbon electrode surface by drop－coatingmethod，and then HRP is linked to the SA－GRmembrane through an am ide bond，thereby the HRP electrochemicalbiosensorwith good performance is prepared for hydrogen peroxide．This biosensor has high sensitivity，good reproducibility，fast response（3 s），low Michaelis constant（Km=0．663）and agood linear relationship for detection H2O2in the range from 1．0×10－4to1．2×10－3mol/L．The detection limitwasestimated tobe5．7×10－6mol/L．
sodium alginate;graphene;horseradish peroxidase
國家自然科學(xué)基金（批準(zhǔn)號(hào)：J1210040，J1103312）
*通訊聯(lián)系人，Email：zywu＠hnu．edu．cn
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(1.湖南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，化學(xué)生物傳感與計(jì)量學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南長沙 410082)（2.懷化學(xué)院化學(xué)與化學(xué)工程系，湖南懷化 418008）
基于石墨烯-海藻酸鈉復(fù)合材料的辣根過氧化物酶?jìng)鞲衅餮芯?/p>
肖福兵1，楊欣1，2，田銳1，張瑞蓮1，梅瓊之1，吳朝陽1*
(1.湖南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，化學(xué)生物傳感與計(jì)量學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南長沙 410082)（2.懷化學(xué)院化學(xué)與化學(xué)工程系，湖南懷化 418008）
構(gòu)建了一種以海藻酸鈉－石墨烯（SA－GR）為基底的新型過氧化氫電化學(xué)酶?jìng)鞲衅?。利用滴涂法將生物相容性良好的海藻酸鈉－石墨烯復(fù)合物固定在玻碳電極表面，再通過酰胺鍵將HRP連接在SA－GR復(fù)合膜上，從而制備出了性能良好的過氧化氫電化學(xué)酶?jìng)鞲衅?。該傳感器重現(xiàn)性好、靈敏度較高，并且響應(yīng)速度快（3 s），米氏常數(shù)較低（Km=0．663），對(duì)H2O2檢測(cè)的線性范圍為1．0×10－4～1．2×10－3mol/L，檢測(cè)下限為5．7×10－6mol/L。
海藻酸鈉；石墨烯；辣根過氧化物酶
0 引言
石墨烯作為一種新型的二維納米材料，其晶體薄膜只有一個(gè)碳原子的厚度，是目前室溫下導(dǎo)電速度最快、導(dǎo)熱能力最強(qiáng)、力學(xué)強(qiáng)度最大的材料之一。因其獨(dú)特的性質(zhì)，石墨烯引起了極大的關(guān)注，在工業(yè)中有了廣泛的應(yīng)用，如儲(chǔ)能［1］，催化劑載體［2］，熱傳輸介質(zhì)［3］和電子元件［4］等。同時(shí)，石墨烯具有良好的生物相容性，所以其在電化學(xué)生物傳感器中也廣泛被應(yīng)用［5～7］。
海藻酸鈉，又叫褐藻酸鈉，是從褐海藻中提取出的天然多糖，具有良好的親水性，生物相容性，并且無毒性。在Ca2+存在下能形成不溶于水的海藻酸鈣凝膠，海藻酸鈣常用作生物催化劑的負(fù)載基底。同時(shí)，海藻酸鈉又是一種很好的成膜材料，能與其它材料在電極表面形成復(fù)合膜，其表面可以固定蛋白質(zhì)或其它生物分子［8～9］。
過氧化氫，在生物體內(nèi)，是許多酶催化反應(yīng)的代謝產(chǎn)物，是體內(nèi)氧化應(yīng)激重要的標(biāo)志物［10］；在工業(yè)生產(chǎn)中，是工業(yè)和食品等領(lǐng)域的副產(chǎn)物。此外，在臨床、藥物和環(huán)境分析等領(lǐng)域過氧化氫含量的測(cè)定也非常重要［11～12］。隨著分析方法的不斷發(fā)展，測(cè)定過氧化氫的方法也越來越多，如滴定分析法［13］、熒光法［14］、高效液相色譜法［15］、比色法［16］、分光光度法［17］、化學(xué)發(fā)光法［18］和電化學(xué)法［19］等。其中，電化學(xué)方法由于具有操作簡(jiǎn)單，選擇性和靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于過氧化氫的分析。
該文利用海藻酸鈉、石墨烯復(fù)合材料在電極表面共同成膜，再通過Ca2+對(duì)膜進(jìn)行交聯(lián)固化后，用EDC/NHS活化復(fù)合膜表面的羧基，最后通過酰胺鍵將辣根過氧化物酶固定在電極表面，從而構(gòu)建出一種以海藻酸鈉和石墨烯為基底的新型過氧化物酶電化學(xué)傳感器，并研究了該傳感器對(duì)過氧化氫的分析測(cè)定和其電化學(xué)行為。
1 實(shí)驗(yàn)部分
1.1 試劑和儀器
海藻酸鈉（SA，Sigma－Aldrich）；石墨烯（GR，南京先豐納米材料有限公司）；辣根過氧化物酶（HRP，上海鼎國生物技術(shù)有限公司）；1－（3－二甲氨基丙基）－3－乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC，Sigma－Aldrich）；N－羥基丁二酰亞胺（NHS，上海源葉生物科技有限公司）；0．3μm和0．05μm鋁粉（上海辰華儀器有限公司）;二水磷酸氫二鈉、十二水磷酸二氫鈉、鐵氰化鉀、亞鐵氰化鉀、氯化鉀、氯化鈣均購于（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分析純）。其它試劑均為分析純，所用到的水溶液均用超純水（R=18．25MΩ）配制。
CHI900B電化學(xué)工作站（上海辰華儀器有限公司）；三電極系統(tǒng)：修飾辣根過氧化物酶－海藻酸鈉－石墨烯的玻碳電極（HRP－SA－GR/GC）作為工作電極，飽和Hg2Cl2電極（SCE）作為參比電極，鉑電極（Pt）作為對(duì)電極。
1.2 海藻酸鈉-石墨烯修飾電極的制備及HRP的固定
取4mg石墨烯和4mg海藻酸鈉于3mL的血清瓶中，加入2mL滅菌水，對(duì)其超聲分散2 h，得到均勻分散的黑色懸濁液（SA－GR）。將此懸濁液置于冰箱4℃保存?zhèn)溆谩?/p>
玻碳電極的預(yù)處理：玻碳電極在使用前，首先分別用0．3μm和0．05μm的氧化鋁粉末打磨處理，至電極表面成光滑的鏡面，再將電極分別用超純水、乙醇、超純水各超聲5min洗凈，最后用N2吹干。
在已預(yù)處理的玻碳電極表面滴加8μL已制備的SA－GR黑色懸濁液，在室溫條件下讓其自然干燥；待完全風(fēng)干后，在其上滴加5μL 4% CaCl2溶液，反應(yīng)1 h，讓海藻酸鈉與Ca2+反應(yīng)生成不溶于水的海藻酸鈣，超純水清洗電極表面未反應(yīng)的Ca2+，氮?dú)獯蹈?；?μL EDC（126mmol/L）/ NHS（63mmol/L）溶液滴在修飾電極表面，活化羧基1 h；最后，8μL 20mg/mLHRP滴在上面已修飾好的電極表面，放于濕度為100%、溫度為4℃的密閉容器中反應(yīng)過夜。這樣即制得了辣根過氧化物酶?jìng)鞲衅鳎℉RP－SA－GR/GC）。構(gòu)建過程如圖1所示。
2 結(jié)果與討論
2.1 電極修飾過程的電化學(xué)表征
采用循環(huán)伏安法對(duì)電極的修飾過程進(jìn)行了表征。圖2是不同電極在電位區(qū)間為0．3～－0．8 V、緩沖液為0．1 mol/L PBS（pH=7．0）中的循環(huán)伏安曲線。由圖2可知，裸玻碳電極（GC）（曲線c）和SA－GR修飾的玻碳電極（曲線b）均未出現(xiàn)明顯的氧化還原峰，但是SA－GR修飾的玻碳電極背景電流有顯著增加，這說明GR－SA顯著地增大了電極的導(dǎo)電能力和有效表面積。HRPSA－GR電極（曲線a）在－0．4 V和－0．1 V附近出現(xiàn)了一對(duì)氧化還原峰，通過與曲線a、b進(jìn)行對(duì)比可知這是HRP的氧化還原峰。綜合比較圖2曲線a、b、c可得知，HRP成功的被修飾在SA－GR基底表面并且能夠較好的進(jìn)行直接電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)。
2.2 掃描速度對(duì)峰電流的影響
考察了掃描速度對(duì)HRP－SA－GR/GC峰電流的影響，分別選取掃速為100、200、300、400、500 mV/s。如圖3，HRP－SA－GR/GC的氧化還原峰電流隨著掃描速率的增加而增大。由圖4可知氧化、還原峰電流與掃描速率（100～500mV/s）呈良好的線性關(guān)系，說明在該掃描速率范圍內(nèi)，電極反應(yīng)受表面過程控制。
圖1 辣根過氧化物酶?jìng)鞲衅鳂?gòu)建示意圖Fig．1 The schematic of the HRPbiosensor fabrication process
圖2 不同修飾電極的循環(huán)伏安圖a）HRP－SA－GR/GC，b）SA－GR/GC和c）GCFig．2 The CVsof differentmodified electrodes a）HRP－SA－GR/GC，b）SA－GR/GC and c）GC
圖3 不同掃速下的循環(huán)伏安圖a～e：500、400、300、200和100mV/sFig．3 The CVsof themodified electrodeatdifferentscan rates．a(chǎn)～e：500、400、300、200 and 100mV/s
2.3 pH值對(duì)催化活性的影響
由于酶的活性受pH值的影響很大，實(shí)驗(yàn)研究了緩沖液的pH值對(duì)酶?jìng)鞲衅鞯挠绊?。圖5（A～E）是酶電極在pH6．0～pH8．0的PBS中加入1 mmol/LH2O2的計(jì)時(shí)電流曲線。由圖5（F）可知，在pH6．0～pH8．0的范圍內(nèi)，隨著pH的增大i-t曲線響應(yīng)電流的變化先增大后減小，在pH=7．0時(shí)響應(yīng)電流為最大值，同時(shí)比較圖5（A～E）可以看出，當(dāng)pH=6．0時(shí)酶電極的響應(yīng)時(shí)間變長，響應(yīng)時(shí)間由最快的3 s延長到20 s以上，這可能是由于pH過低導(dǎo)致酶電極活性受到抑制，因此選擇pH= 7．0的PBS作為檢測(cè)緩沖溶液。
2.4 干擾實(shí)驗(yàn)
為了考察酶電極的特異性，加入了一些常見的干擾物質(zhì)來研究傳感器的抗干擾能力。如圖6所示，向pH=7．0的PBS溶液中依次加入1 mmol/LH2O2、10mmol/L葡萄糖（GLC）、10mmol/L抗壞血酸（AA）；以酶電極為工作電極，在－0．4 V下進(jìn)行計(jì)時(shí)電流掃描。從圖中可以很明顯的看出，相對(duì)于H2O2的電流響應(yīng)抗壞血酸和葡萄糖的電流響應(yīng)很小，基本可以忽略。說明此傳感器對(duì)H2O2有著良好的選擇性，具有很好的抗干擾能力。
圖4 峰電流與掃描速度的關(guān)系Fig．4 The relationship between peak currentand the sweep rate
圖5 不同pH值下催化H2O2的計(jì)時(shí)電流曲線Fig．5 Amperometric responsesofH2O2catalysed atdifferentpH values
2.5 對(duì)過氧化氫的計(jì)時(shí)電流響應(yīng)
為了研究HRP－SA－GR/GC中HRP對(duì)過氧化氫的電催化能力，分別對(duì)SA－GR/GC和HRPSA－GR/GC在PBS緩沖溶液（pH=7．0，0．1mol/L）中進(jìn)行計(jì)時(shí)電流掃描，如圖7所示，曲線a為HRP－SA－GR/GC在加入1mmol/LH2O2的緩沖溶液中的計(jì)時(shí)電流曲線，曲線b為SA－GR/GC在加入1mmol/LH2O2的緩沖溶液中的計(jì)時(shí)電流曲線?？梢缘弥猄A－GR/GC的電流響應(yīng)較小，而HRP－SA－GR/GC電極對(duì)過氧化氫的響應(yīng)明顯，曲線a的響應(yīng)電流約為曲線b的7倍。對(duì)比可知，曲線a相對(duì)于曲線b增大的電流即是HRP對(duì)H2O2的催化還原電流。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，固定在SA－GR上的HRP保持其良好的生物催化活性，能有效催化H2O2的電化學(xué)還原。
同時(shí)，通過采用計(jì)時(shí)電流實(shí)驗(yàn)研究了酶電極的電流響應(yīng)與H2O2濃度之間的關(guān)系。實(shí)驗(yàn)的電位設(shè)定在－0．4 V，緩沖液為pH=7．0的PBS（通入N2除氧），實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖8，圖9所示，HRP－SAGR/GC對(duì)H2O2的響應(yīng)隨著其濃度的增加，響應(yīng)電流逐漸變大，當(dāng)加入的H2O2濃度越大，電流變化越明顯；并且響應(yīng)電流與過氧化氫的濃度在1．0×10－4～1．2×10－3mol/L范圍內(nèi)呈現(xiàn)出了良好的線性關(guān)系。線性方程為：I（μA）=2．83+0．003 8 c（μmol/L）（r=0．998）。基于3倍信噪比，可求得該傳感器的檢測(cè)下限為5．7×10－6mol/L（S/N=3）。
圖6 干擾實(shí)驗(yàn)Fig．6 Interference experiment
圖7 不同修飾電極對(duì)1mmol/LH2O2的響應(yīng)a）HRP－SA－GR/GC和b）SA－GR/GCFig．7 The responseofdifferentelectrodes for1mmol/L H2O2．a(chǎn)）HRP－SA－GR/GCand b）SA－GR/GC
圖8 連續(xù)加入100μmol/LH2O2的計(jì)時(shí)電流響應(yīng)曲線Fig．8 The response forsuccessiveaddition of100μmol/L H2O2
圖9 H2O2濃度與電流的線性關(guān)系Fig．9 The linear relationship between the concentration of H2O2and the current
2.6 HRP-SA-GR/GC表觀米氏常數(shù)的測(cè)定
如圖9，酶電極HRP－SA－GR/GC測(cè)定H2O2時(shí)，當(dāng)過氧化氫的濃度較小時(shí)，它的穩(wěn)態(tài)響應(yīng)電流I隨c線性增大；當(dāng)c較大時(shí)，I與c基本無關(guān)，表現(xiàn)出Michaelis－Menten的動(dòng)力學(xué)特征。根據(jù)Michaelis－Menten方程Iss－1=1/Imax+Km/（Imaxc），其中的Iss為加入一定濃度底物后的響應(yīng)電流，Imax為所加底物飽和時(shí)的極限（最大）電流，c為加入的底物濃度，米氏常數(shù)是表征酶與底物之間親和力的統(tǒng)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)［20］。通過對(duì)H2O2的濃度的倒數(shù)（c－1）和其對(duì)應(yīng)的電流響應(yīng)的倒數(shù)（Iss－1）作圖（圖10）可求算出該生物傳感器的米氏常數(shù)為0．663mmol/L，這比文獻(xiàn)中報(bào)道的值要?。?1～24］。較小的米氏常數(shù)表明通過該方法固定的酶能保持其良好催化活性，同時(shí)也說明它與H2O2的親和力較大。
圖10 米氏常數(shù)的測(cè)定Fig．10 The determ ination ofm ichaelis constant
3 結(jié)論
通過滴涂法把生物相容性良好的復(fù)合膜SA－GR固定到電極表面，然后再通過酰胺鍵將HRP固定在SA－GR復(fù)合膜上，從而制備出了性能良好的過氧化氫電化學(xué)酶?jìng)鞲衅?。HRP在PBS緩沖液中能發(fā)生直接電子轉(zhuǎn)移。該傳感器靈敏度較高，重現(xiàn)性好，具有較低的米氏常數(shù)（Km=0．663），對(duì)H2O2的檢測(cè)線性范圍為1．0×10－4～1．2×10－3mol/L，檢測(cè)下限為5．7×10－6mol/L（S/N= 3），響應(yīng)時(shí)間低至3 s。SA－GR復(fù)合材料為生物催化和生物電化學(xué)傳感器的研究提供了一個(gè)良好的檢測(cè)平臺(tái)。
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Graphene-sodium alginate com positebased horseradish peroxidase biosensor
Xiao Fu-bing1，Yang Xin1，2，Tian Rui1，Zhang Rui-lian1，MeiQiong-zhi1，Wu Zhao-yang1*
（1．State Key Laboratory ofChemo/Biosensingand Chemometrics，CollegeofChemistry and ChemicalEngineering，Hunan University，Changsha410082，China）（2．DepartmentofChemistry and Chemical Engineering，Huaihua Collge，Huaihua418008，China）
A new type of enzyme electrochemicalsensor for hydrogen peroxidewas constructed alginate－graphene（SA－GR）composite．The biocompatible alginate－graphene composite is fixed to the glassy carbon electrode surface by drop－coatingmethod，and then HRP is linked to the SA－GRmembrane through an am ide bond，thereby the HRP electrochemicalbiosensorwith good performance is prepared for hydrogen peroxide．This biosensor has high sensitivity，good reproducibility，fast response（3 s），low Michaelis constant（Km=0．663）and agood linear relationship for detection H2O2in the range from 1．0×10－4to1．2×10－3mol/L．The detection limitwasestimated tobe5．7×10－6mol/L．
sodium alginate;graphene;horseradish peroxidase
國家自然科學(xué)基金（批準(zhǔn)號(hào)：J1210040，J1103312）
*通訊聯(lián)系人，Email：zywu＠hnu．edu．cn
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