反相高效液相色譜法測定胖血藤中大黃素和大黃素甲醚含量

薛朝金，陶 凱

（1．貴州省畢節(jié)市食品藥品檢驗所，貴州 畢節(jié) 551700； 2．貴陽中醫(yī)學院，貴州 貴陽 550002）

胖血藤為蓼科植物毛血藤 Polygonum cynanchodiis Hemsl．的干燥根，別名有蕎麥蔓、毛血藤、云扣蓮、蕎葉細辛，廣泛分布于湖北、四川、貴州等省，生長于河岸或山溝草叢中[1]。該藥材已收載于2003年版《貴州省中藥材、民族藥材質量標準》，具有斂肺止咳、行氣健胃、祛風除濕的功效，主要用于肺癆咳嗽、痰中帶血、白日咳、胃脘脹悶疼痛、風濕痹痛[2]。該質量標準只規(guī)定了來源、性狀、性味歸經、功能主治、用法用量及貯藏。該藥材為貴州省少數民族用藥，其分布廣、藥用價值高，目前未發(fā)現(xiàn)有對胖血藤含量測定方法研究的報道。為保證藥材質量和療效，筆者建立了其含量測定方法，現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

高效液相色譜儀（Waters 1525二元高壓梯度泵，2487 Dual λ absorbance Detector，柱溫箱，Breeze色譜工作站；島津 LC－20AD二元高壓梯度泵，SPD－M20D二級管陣列檢測器）；AB265－S型電子天平（瑞士 Mettle Toledo公司）。大黃素對照品（批號為110756－200110）、大黃素甲醚(批號為 110758－200610)，均購自中國藥品生物制品檢定所；甲醇為色譜純（美國天地公司），水為自制超純水，其他試劑均為分析純。試驗所用的3批胖血藤藥材經畢節(jié)市食品藥品檢驗所汪勛副教授鑒定為蓼科植物毛血藤Polygonum cynanchodiis Hemsl．的干燥根。

2 方法與結果

2．1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱：Diamonsil C18柱（250 mm ×4．6 mm，5 μm）；流動相：甲醇 －0．1% 磷酸（80 ∶20）；流速：1．0 mL ／min；柱溫：30 ℃ ；檢測波長：254 nm；進樣量：20 μL。在此色譜條件下，大黃素、大黃素甲醚與其他組分分離度良好，色譜圖見圖1。

2．2 溶液制備

圖1 高效液相色譜圖

精密稱取大黃素對照品10 mg，加甲醇稀釋至25 mL，精密稱取大黃素甲醚對照品13 mg加甲醇稀釋至100 mL，即得對照品貯備液，備用。精密稱取樣品0．5 g，置具塞錐形瓶中，精密加甲醇50 mL，精密稱定質量，于水浴上加熱回流 1 h，放冷，加甲醇補足減失的質量，用0．45 μm的濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2．3 方法學考察

線性關系考察：取對照品貯備液適量，分別制成含大黃素5，10，20，40，80 μg ／mL，含大黃素甲醚 1．562 5，3．125，6．25，9．375，12．5 μg ／mL 的混合溶液，精密吸取 20 μL，注入高效液相色譜儀，按擬訂色譜條件分別測定峰面積。以對照品進樣量（X，μg）為橫坐標、峰面積(Y)為縱坐標進行線性回歸，得大黃素回歸方程Y＝4×106X＋11 534(r＝0．999 9)，大黃素甲醚回歸方程 Y＝3×106X － 1 340．2(r＝0．999 7)。結果表明，大黃素、大黃素甲醚進樣量分別在 0．100 0 ～1．600 0 μg和 0．031 25 ～0．250 0 μg范圍內與峰面積呈良好線性關系。

精密度試驗：精密吸取質量濃度為20 μg／mL的大黃素和質量濃度為6．25 μg／mL的大黃素甲醚混合對照品溶液，按擬訂色譜條件，連續(xù)進樣6次測定峰面積。結果大黃素對照品峰面積的RSD為0．55%，大黃素甲醚對照品峰面積的 RSD為1．40%，表明儀器精密度良好。

重復性試驗：取同一批次的胖血藤藥材6份，每份0．5 g，精密稱定，按2．2項下方法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件測定。結果胖血藤中大黃素和大黃素甲醚的大黃素平均含量分別為0．24%和 0．059%，RSD 分別為 1．17%和 1．35%，表明方法重現(xiàn)性良好。

穩(wěn)定性試驗：取同一供試品溶液，精密吸取20 μL，分別在0，2，4，8，12，24 h 時進樣測定。結果大黃素峰面積的 RSD 為 0．78% ，大黃素甲醚峰面積的 RSD為1．56%，表明供試品溶液在24 h內穩(wěn)定。

檢測限與定量限確定：采用信噪比法，把已知質量濃度的供試品測出的信號與空白樣品測出的信號進行比較。以信噪比為3∶1時為檢測限，計算得大黃素的檢測限為2．4 ng，大黃素甲醚的檢測限為3．25 ng；以信噪比為10∶1時為定量限,計算得大黃素的定量限為8 ng，大黃素甲醚的定量限為14．625 ng。

加樣回收試驗：取已知含量（大黃素 0．24%，大黃素甲醚0．062%）的胖血藤粉末（過 4號篩）約0．25 g共6份，精密稱定，置錐形瓶中分別精密加入大黃素對照品溶液 15 mL（40 μg／mL）、大黃素甲醚對照品溶液 15 mL（12．5 μg ／mL）和甲醇 20 mL，稱定質量，水浴回流 1 h，放冷，用微孔濾膜（0．45 μm）濾過，取續(xù)濾液，按擬訂色譜條件測定含量，計算回收率。結果見表1。

表1 大黃素與大黃素甲醚加樣回收試驗結果(n＝6)

2．4 樣品含量測定

按2．2項下方法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件測定3批樣品中的大黃素和大黃素甲醚的含量。結果見表2。

表2 不同批次胖血藤藥材大黃素和大黃素甲醚含量測定結果

3 討論

被測成分：根據植物的親緣關系，相同科屬的植物可能含有相同化學成分的特點，初步推斷胖血藤可能含大黃素等蒽醌類化合物。因此先采用薄層色譜法[3]對其進行薄層分析，結果在與大黃素、大黃素甲醚對照品相同位置顯相同顏色的斑點，初步證實胖血藤藥材中含有大黃素和大黃素甲醚。采用高效液相色譜－二極管陣列檢測器檢測，結果在與大黃素、大黃素甲醚對照品相同保留時間處有相對應的色譜峰，并且相對應的色譜峰的紫外－可見光譜圖一致，確定胖血藤藥材中含有大黃素及大黃素甲醚。

檢測波長：大黃素及大黃素甲醚（甲醇溶解）在222，254，310 nm波長處有最大吸收。當選用222 nm為檢測波長時，其他成分的吸收大，使得大黃素和大黃素甲醚峰的顯示相對較小而不明顯；而選擇310 nm為檢測波長時基線不穩(wěn)定，有干擾；選擇254 nm為檢測波長時，基線穩(wěn)定，分離效果較好。因此選擇254 nm作為其檢測波長。

流動相：曾經用水和甲醇為流動相，結果峰形太差，無法進行積分計算。然后改用甲醇 － 0．1% 磷酸（80 ∶20）[3]為流動相，基線穩(wěn)定，色譜峰峰形較好，分離度滿足要求，因此確定流動相用甲醇 － 0．1% 磷酸(80 ∶20)。

提取條件：分別比較了不同提取溶劑（甲醇、乙醇），不同提取方法（加熱回流提取和超聲提取），不同提取時間（0．5，1，1．5 h），最后確定采用甲醇加熱回流提取1 h，胖血藤中大黃素和大黃素甲醚的含量達到最大。

參考文獻：

[1]全國中草藥匯編編寫組．全國中草藥匯編(下冊)[M]．北京:人民衛(wèi)生出版社，1978:146．

[2]貴州省藥品監(jiān)督管理局．貴州省中藥材、民族藥材質量標準[M]．貴陽:貴州科學技術出版社，2003:288．

[3]國家藥典委員會．中華人民共和國藥典（一部）[M]．北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010:22．