H PLC法測(cè)定治傷消瘀丸中士的寧和馬錢(qián)子堿的含量

馬向東 郭海麗

（1濮陽(yáng)市食品藥品檢驗(yàn)所，河南濮陽(yáng) 457000；2河南華峰制藥有限公司）

H PLC法測(cè)定治傷消瘀丸中士的寧和馬錢(qián)子堿的含量

馬向東1郭海麗2

（1濮陽(yáng)市食品藥品檢驗(yàn)所，河南濮陽(yáng) 457000；2河南華峰制藥有限公司）

目的：建立治傷消瘀丸中士的寧和馬錢(qián)子堿含量測(cè)定的方法。方法：采用高效液相色譜法，色譜柱為Kromasil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；以甲醇-0.01 mol/L磷酸氫二鉀溶液（27∶73）（用10%磷酸調(diào)節(jié)pH至2.5）為流動(dòng)相；流速為1.0 mL/min；柱溫30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為260 nm。結(jié)果：士的寧在0.129 8～1.297 6 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r=0.999 3，n=6），平均回收率為98.77%（RSD＝1.10%，n=6）；馬錢(qián)子堿在0.110 7～1.107 2 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r=0.999 1，n=6），平均回收率為98.73%（RSD＝0.68%，n=6）。結(jié)論：該方法操作簡(jiǎn)單，分離度高，回收率好，適用于治傷消瘀丸的質(zhì)量控制。

治傷消瘀丸；士的寧；馬錢(qián)子堿；高效液相色譜法；含量測(cè)定

治傷消瘀丸由馬錢(qián)子（沙炒）、土鱉蟲(chóng)（炒）、乳香（制）、自然銅（煅、飛）、骨碎補(bǔ)（去毛）、沒(méi)藥（制）、麻黃、香附（制）、紅花、蒲黃、赤芍、桃仁等14味中藥組成，具有消瘀退腫功效，用于骨骼與關(guān)節(jié)損傷和瘀腫疼痛，適用于筋骨疼痛，跌打損傷，瘀血痹癥，筋斷骨折。原標(biāo)準(zhǔn)收載于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)（中藥成方制劑第十冊(cè)）》，只有顯微鑒別[1]。方中馬錢(qián)子具有通絡(luò)止痛，散結(jié)消腫的功效，為方中主藥，且有大毒，必須加以控制。本研究參考有關(guān)文獻(xiàn)，對(duì)方中主藥馬錢(qián)子中的士的寧和馬錢(qián)子堿進(jìn)行了含量測(cè)定的研究，建立了測(cè)定方法，為控制該產(chǎn)品的質(zhì)量提供依據(jù)

1 儀器與試藥

Agilent 1260高效液相色譜儀，配有四元梯度泵和Agilent chenstation數(shù)據(jù)工作站（DEABJ00471）；Sartorius CPA 225D分析天平（26190055）。

士的寧對(duì)照品（批號(hào)：110705-200306）、馬錢(qián)子堿對(duì)照品（批號(hào)：110706-200510）均購(gòu)自原中國(guó)藥品生物制品檢定所。治傷消瘀丸（規(guī)格：32粒重5 g，批號(hào)：20120901、20120902、20120903）及陰性對(duì)照品均由河南華峰制藥有限公司提供；甲醇為色譜純，水為娃哈哈純凈水，其他試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Kromasil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；以甲醇-0.01 mol/L磷酸氫二鉀溶液（27∶73）（用10%磷酸調(diào)節(jié)pH至2.5）作為流動(dòng)相；流速為1.0 mL/min，柱溫30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為260 mm。理論塔板數(shù)大于2 000，在此條件下，士的寧和馬錢(qián)子堿與相鄰組分均能達(dá)到完全分離。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取士的寧對(duì)照品16.22 mg和馬錢(qián)子堿對(duì)照品13.84 mg至50 mL量瓶中，溶解并加甲醇至刻度，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液。再精密量取上述儲(chǔ)備液5 mL至25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，制成濃度分別為0.064 88，0.055 36 mg/mL的混合溶液，作為對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取本品10 g，研細(xì)，取約3 g，精密稱定，置具塞三角瓶中，加氫氧化鈉試液2 mL潤(rùn)濕后，精密加三氯甲烷50 mL,密塞，稱定重量，振搖30 min，浸泡24 h，再稱定重量，用三氯甲烷補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)。精密吸取續(xù)濾液25 mL，置分液漏斗中，用0.5 mol/L的硫酸溶液提取3次，每次15 mL，合并酸液，濾過(guò)，濾液置50 mL量瓶中，用少量0.5 mol/L的硫酸溶液洗滌濾器，洗液與濾液合并，用0.5 mol/L的硫酸溶液稀釋至刻度，搖勻，即得。另取不含馬錢(qián)子藥材的陰性對(duì)照品,按供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照品溶液。

2.4 測(cè)定方法

分別吸取對(duì)照品溶液、樣品溶液和陰性對(duì)照品溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀，測(cè)定，記錄色譜圖，以外標(biāo)法分別計(jì)算士的寧和馬錢(qián)子堿的含量。

2.5 陰性對(duì)照品的測(cè)定

取不含馬錢(qián)子藥材的陰性樣品，按2.3項(xiàng)下方法操作，得陰性對(duì)照溶液。依法測(cè)定，結(jié)果表明陰性液無(wú)干擾。見(jiàn)圖1

圖1 治傷消瘀丸HPLC圖

2.6 方法學(xué)考察

2.6.1 線性關(guān)系考察分別精密吸取對(duì)照品溶液各2，4，8，12，16，20 μL，按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，色譜峰面積為縱坐標(biāo)分別進(jìn)行作線性回歸。結(jié)果士的寧、馬錢(qián)子堿回歸方程分別為：

表明士的寧在0.129 8～1.297 6 μg，馬錢(qián)子堿在0.110 7～1.107 2 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.6.2 精密度試驗(yàn)精密吸供試品溶液的10 μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，分別記錄士的寧和馬錢(qián)子堿峰面積。結(jié)果士的寧和馬錢(qián)子堿峰面積的RSD分別為0.76%，0.95%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.6.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)將供試品溶液分別在制備后0，1，2，4，8，12 h時(shí)進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果士的寧和馬錢(qián)子堿峰面積的RSD分別為1.55%，1.80%（n= 6），表明12 h內(nèi)樣測(cè)定，樣品穩(wěn)定性良好。

2.6.4 重復(fù)性試驗(yàn)精密稱取取同批號(hào)的樣品（批號(hào)：111023），按供試品溶液的制備方法制備6份樣品溶液，依法測(cè)定。分別計(jì)算含量和RSD，結(jié)果士的寧平均含量為1.437 mg/g，RSD為0.89%（n=6）。馬錢(qián)子堿的含量為1.172 mg/g，RSD為1.39%（n=6）。

2.6.5 加樣回收率試驗(yàn)采用加樣回收法，精密稱取樣品6份，每份約3 g分別加入對(duì)照品儲(chǔ)備液6 mL，照供試品溶液制備方法制備供試液，依法測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.7 樣品含量測(cè)定

取樣品（批號(hào)：111023，111215，120307）按2.2處理，按實(shí)驗(yàn)中所建立的方法進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果每克含士的寧分別為1.44，1.37，1.42 mg，馬錢(qián)子堿分別含1.17，1.05，1.12 mg。

3 討論

3.1 《中國(guó)藥典》（2010年版）一部規(guī)定，馬錢(qián)子藥材中士的寧的含量為1.20%～2.20%，馬錢(qián)子堿的含量不得少于0.80%[2]，查閱有關(guān)文獻(xiàn)[3-5]并根據(jù)本公司的馬錢(qián)子藥材檢驗(yàn)情況，在設(shè)計(jì)對(duì)照品濃度線性范圍時(shí)，濃度選擇相對(duì)較低。在數(shù)據(jù)處理時(shí)，對(duì)于樣品處理過(guò)程中加入的2 mL氫氧化鈉潤(rùn)濕試液，是否參與計(jì)算未找到相關(guān)文獻(xiàn)，2 mL試液未定量加入，且基本被藥材粉末吸收，綜合考慮，未參與計(jì)算。

3.2 按藥典馬錢(qián)子的測(cè)定方法的流動(dòng)相，乙腈-0.01 mol/L庚烷磺酸鈉與0.02 moI/L磷酸二氫鉀等量混合溶液（用10%磷酸調(diào)節(jié)pH值2.8）（21∶79）和0.01 mol/L磷酸氫二鉀溶液-甲醇（73∶27）（用10%磷酸調(diào)節(jié)至pH至2.5）進(jìn)行比較，結(jié)果士的寧和馬錢(qián)子堿的出峰順序正好相反；同為酸性緩沖鹽，一個(gè)加乙腈，一個(gè)加甲醇為什么出峰順序相反，有待進(jìn)一步研究。當(dāng)檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm，士的寧的峰高遠(yuǎn)大于馬錢(qián)子堿，而在260 nm下檢測(cè)，兩者峰面積大小差別不大。綜合考慮，甲醇-0.01 mol/L磷酸氫二鉀溶液（27∶73）（用10%磷酸調(diào)節(jié)pH至2.5）為流動(dòng)相，波長(zhǎng)選擇260 nm。

3.3 不同品牌色譜柱及填料比較Kromasil C18柱、Welchrom C18柱、Thermo ELECTRON CORPORATION ODS-3填料柱和依利特Sinochrom ODS-BP填料色譜柱，除了保留時(shí)間不同外，含量測(cè)定結(jié)果無(wú)明顯差異。

3.4 本實(shí)驗(yàn)以士的寧和馬錢(qián)子堿為指標(biāo)，建立含量測(cè)定方法，經(jīng)過(guò)方法驗(yàn)證，表明該方法重復(fù)性好，精密度高，穩(wěn)定性好，回收率符合要求，可以用于本產(chǎn)品的質(zhì)量控制。

[1]衛(wèi)生部藥典委員會(huì).衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)（中藥成方制劑第十冊(cè)）[S].1995：98.

[2]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典（2010年版）一部[S].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：47.

[3]郭社民.RP-HPLC測(cè)定治傷消瘀丸中士的寧的含量[J].中國(guó)藥事，1999，13（6）：47.

[4]魯燕俠，崔佳，劉鷹.反相高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定祛痹丹膠囊中士的寧和馬錢(qián)子的含量[J].中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，2001，21（8）：474-475.

[5]劉元，宋志釗，莫海濤，等.HPLC法測(cè)定復(fù)方中風(fēng)康片中士的寧和馬錢(qián)子[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2010，16（6）：74-76.

Content Determination of Strychnine and Brucine in Zhishangxiaoyu Pills by HPLC

Ma Xiangdong1，Guo Haili2（1 The Institute for Food and Drug Control of Puyang City，Henan Puyang 457000，China；2 Huafeng Pharmaceutical Co.，Ltd.of Henan Province）

Objective：To establish a HPLC method for the content determination of strychnine and brucine in zhishangxiaoyu pills.Methods：Kromasil C18column（250 mm×4.6 mm，5 μm）was used with methanol-0.01 mol/L potassium hydrogen phosphate solution（27∶73）（with 10%phosphoric acid for pH adjustment to 2.5）as mobile phase，the flow rate was 1.0 mL/min，column temperature was at 30℃and UV detection was at 260 nm.Results：The calibration curve was linear within the range of 0.129 8～1.297 6 μg（r=0.999 3，n=6）for strychnine and 0.110 7～1.107 2 μg（r= 0.999 1，n=6）for brucine，and the average recovery was and 98.77%（RSD=1.10%，n=6）and 98.73%（RSD=0.68%，n=6）for strychnine and brucine respectively.Conclusion：The method is simple with a high degree of separation and good recovery rate，it is suitable for the quality control of zhishangxiaoyu pills.

Zhishangxiaoyu Pills；Strychnine；Brucine；HPLC；Content Determination

10.3969/j.issn.1672-5433.2014.06.006

2014-01-21）

馬向東，男，主管藥師。研究方向：中藥檢驗(yàn)。通訊作者E-mail：1277311805@qq.com